Ratiometrische Biosensoren dat mitochondriaal Redox Staat en ATP Meet in Living gistcellen

Summary

We beschrijven het gebruik van twee ratiometrische, genetisch gecodeerd biosensoren, die zijn gebaseerd op GFP, om mitochondriale redox staat en ATP-spiegels te controleren bij subcellulaire resolutie in levende gistcellen.

Abstract

Mitochondria rollen in vele cellulaire processen, van energiemetabolisme en calcium homeostase te controleren van cellulaire levensduur en geprogrammeerde celdood. Deze processen beïnvloeden en worden beïnvloed door de redox status en ATP productie mitochondria. Hier beschrijven we het gebruik van twee ratiometrische, genetisch gecodeerd biosensoren die mitochondriale redox staat en ATP niveaus kan detecteren bij subcellulaire resolutie in levende gistcellen. Mitochondriale redoxstatus wordt gemeten met redox-gevoelige Green Fluorescent Protein (roGFP) die is gericht op de mitochondriale matrix. Mito-roGFP bevat cysteïnes op posities 147 en 204 van GFP, die reversibel en omgevingsafhankelijke oxidatie en reductie, die op zijn beurt verandert de excitatie-spectrum van het eiwit ondergaan. MitGO-ATeam een Förster-energieoverdracht (FRET) probe waarin ε subeenheid van het F F _o is _1-ATP synthase ingeklemd tussen FRET donor en acceptor fluorescent eiwitten. Binding van ATP aan de ε subeenheid resulteert in conformatie verandering in het eiwit dat brengen de FRET donor en acceptor in dichte nabijheid en zorgen voor fluorescentie resonantie energieoverdracht van de donor naar acceptor.

Introduction

Mitochondriën zijn organellen essentieel voor ATP productie, biosynthese van aminozuren, vetzuren, heem ijzer zwavel clusters en pyrimidines. Mitochondriën ook spelen cruciale rollen in calcium homeostase, en bij de regulatie van apoptose. ¹ Toenemend bewijs koppelingen mitochondriën tegen veroudering en leeftijd gerelateerde ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, amyotrofe laterale sclerose en de ziekte van Huntington. ² Terwijl individuen leven hun hele leven met veranderingen in mitochondriale eiwitten die worden geassocieerd met neurodegeneratieve aandoeningen, de ziekte symptomen pas later in het leven. Dit geeft aan dat veranderingen in mitochondria leeftijd die pathologie naar voren toe. Inderdaad, wordt mitochondriale fitness gecorreleerd met de algemene gezondheid van de cellen en de levensduur in gist en zoogdiercellen. ^3,4 We beschrijven hier hoe genetisch gecodeerd, ratiometrisch fluorescerende biosensoren gebruiken om twee cruciale kenmerken van mitoc beoordelenhondria in levende gistcellen: redoxtoestand en ATP niveaus.

Mitochondriale functie in aërobe energie mobilisatie is goed ingeburgerd. Mitochondriale redox staat een product te verminderen en oxiderende species in het organel, waaronder NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, glutathion / disulfide glutathion (GSH / GSSG) en reactieve zuurstof species (ROS). Ontkoppelen mitochondriën of hypoxie invloed mitochondriale respiratoire activiteit en verandert de verhouding van NAD ⁺ naar NADH in het organel. ROS, die producten met inefficiënte elektronenoverdracht tussen complexen van de elektronen transportketen in het binnenste mitochondriale membraan, evenals van de deaminering van aminen door monoamine oxidase in de buitenste mitochondriale membraan ^5, beschadiging lipiden, eiwitten en nucleïnezuren en hebben in verband gebracht met veroudering en aanverwante neurodegeneratieve ziekten ^6,7,8. ROS spelen ook een rol bij de signaaloverdracht in mitochondria, door oxidatie van GSH. Bijvoorbeeld, NADH dehydrogenase niet alleen bijdraagt ​​aan ROS productie, maar ook wordt gereguleerd door interacties met de glutathion zwembad ^9,10. α-Ketoglutaraat dehydrogenase en aconitase, onderdelen van de TCA-cyclus, vertonen verminderde activiteit in oxiderende omgevingen ^11,12.

Inderdaad, wordt redox-afhankelijke regulatie van aconitase activiteit behouden van bacteriën tot zoogdieren ^13,14. Zo is het toezicht op de redox staat en ATP niveaus van mitochondria is cruciaal voor het begrijpen van hun functie en rol in de ziekte pathologie.

Biochemische methoden zijn gebruikt om de redox toestand of ATP niveaus van hele cellen te beoordelen of geïsoleerde mitochondria. Gebruikte methoden om de redox toestand van gehele cellen of geïsoleerde mitochondria beoordelen op basis van metingen van de niveaus van de redox pair GSH / GSSG ^15. De luciferine-luciferase-systeem wordt vaak gebruikt om mitochondriale metenATP niveaus in zowel permeabel gehele cellen of geïsoleerde mitochondria. ^{16,17,18,19,20} In deze bepaling bindt aan luciferase en ATP katalyseert de oxidatie van luciferine en chemiluminescentie uit. ²¹ De intensiteit van het uitgezonden licht is evenredig met de van ATP in het reactiemengsel. ²²

Deze methoden zijn fundamentele informatie onthuld over mitochondriale functie, zoals de vaststelling dat patiënten met neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer hebben abnormaal lage ATP. ²³ Evenwel kunnen zij niet worden gebruikt voor beeld levende intacte cellen. Bovendien methoden op basis van hele cellen analyses gemiddeld redox state of ATP in alle compartimenten van de cel. Metingen in geïsoleerde organellen zijn potentieel problematisch omdat mitochondriale redox state-of ATP-niveaus kan veranderen tijdens subcellulaire fractionering. Tot slot, recente studies in ons laboratorium en anderen geven aan datmitochondriën in individuele cellen heterogeen functie, dat op zijn beurt de levensduur van moeder en dochtercellen. ³ Er bestaat derhalve behoefte aan mitochondriale ATP en redoxstatus meten levende cellen met subcellulaire resolutie.

De biosensoren voor mitochondriale beschreven zijn beide gebaseerd op GFP. Redox-gevoelige GFP (roGFP) ^24,25 is een GFP variant waarin oppervlakgeëxponeerde cysteïnen worden toegevoegd aan het molecuul. roGFP, zoals wild-type GFP, heeft twee excitatie pieken (bij ~ 400 nm en 480 nm ~) en een emissie piek bij ~ 510 nm. Oxidatie van de cysteïneresten in roGFP resulteert in een toename van excitatie bij -400 nm. Vermindering van die cysteïnen gunsten excitatie bij ~ 480 nm. Zo is de verhouding van 510 nm emissie bij excitatie van roGFP bij 480 nm en 400 nm toont de relatieve hoeveelheid van gereduceerde en geoxideerde roGFP, waarbij de redox toestand van het milieu de fluorofoor weerspiegelt.

Twee versionen van roGFP worden veel gebruikt: roGFP1 en roGFP2. Beide bevatten dezelfde cysteïne inserties. roGFP1 gebaseerd op de wild-type GFP en roGFP2 gebaseerd op S65T GFP, die efficiënter excitatie bij 480 nm en minder efficiënte excitatie bij 400 nm ten opzichte van wtGFP ^24. roGFP1 is minder pH-gevoelig dan roGFP2 en zijn dynamische bereik strekt zich verder in de lagere bereik. Aldus kan roGFP1 meer nuttig om meer verminderen compartimenten zoals mitochondria of cytosol en vakken met variabele pH, zoals endosomen. roGFP2 biedt helderder signaal en, in sommige studies, een groter dynamisch bereik dan roGFP1 ^24,26. Studies in Arabidopsis thaliana blijkt dat de tijd die reageren op veranderingen in redox toestand gelijk voor beide sensoren (t ½ voor oxidatie, 65 en 95 sec en t ½ tot beperking, 272 en 206 sec voor roGFP1 en roGFP2 respectievelijk). ²⁶

MitGO-ATeam2 is een minimaal invasieve, betrouwbaresensor die mitochondriale ATP meet in de gist Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam een Förster-energieoverdracht (FRET) probe die bestaat uit de ε-subeenheid van de F F _{o 1-ATP} synthase ingeklemd tussen FRET donor en acceptor fluorescerende eiwitten (GFP en oranje fluorescerend eiwit (OFP), respectievelijk). ²⁷ binding van ATP aan de ε-subeenheid leidt tot conformatieveranderingen in het eiwit die brengen de FRET-donor in de nabijheid van de acceptor en zorgen voor energieoverdracht van donor naar acceptor. Er zijn twee varianten van de GO-ATeam, GO-ATeam1 en GO-ATeam2. GO-ATeam2 een hogere affiniteit voor MgATP dan GO-ATeam1, waardoor het ge-schikt voor potentieel lagere [ATP] in mitochondria opzichte van de cytosol. ²⁷

De mitochondriale redox toestand sonde, construeerden we een fusie-eiwit (mito-roGFP1) bestaande uit roGFP1 gefuseerd met de ATP9 leader sequentie eennd expressie van een centromeer verkregen (low copy number) plasmide van gist expressie onder controle van de sterke glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GPD) promoter (p416GPD, Addgene). We gebruikten roGFP1 de redox status van mitochondria sonde in de context van de veroudering van het model schimmel Saccharomyces cerevisiae. We vinden dat roGFP1 kan detecteren veranderingen in mitochondriale redox toestand die tijdens veroudering en in reactie op beschikbaarheid van voedingsstoffen, maar heeft geen zichtbaar nadelig effect op gistcellen. We zien ook variabiliteit in de redox toestand van de mitochondriën in individuele levende gistcellen, een bevinding die het belang van een biosensor met subcellulaire ruimtelijke resolutie onderstreept.

MitGO-ATeam2 is een variant van GO-ATeam2, waarbij de signaalsequentie van mitochondriale cytochroom c oxidase subeenheid VIII A toegevoegd aan de aminoterminus van GO-ATeam2 heeft. ²⁷ We pasten de mitGO-ATeam2 probe (vriendelijk verschaft door het laboratorium van H. Noji, Instituut of Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek, Universiteit van Osaka, Japan) voor gebruik in gist door subkloneren het, via Xba1 en HindIII plaatsen, in de gistexpressievector pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), dat is een low-copy plasmide met de sterke constitutieve GPD promoter. We uitgedrukt mitGO-ATeam2 in gist, aanbod door tegenkleuring met de DNA-bindende kleurstof DAPI, dat lokaliseert uitsluitend mitochondriën, waar het als een effectieve probe om fysiologische veranderingen in mitochondriale ATP te meten.

roGFP en GO-ATeam zijn zowel genetisch gecodeerd. Daardoor kunnen ze worden geïntroduceerd en stabiel gehandhaafd in intacte cellen en informatie over redoxstatus of ATP in individuele, levende cellen. Bovendien hebben beide biosensoren monitoren veranderingen in redox staat of ATP-niveaus die optreden onder fysiologische omstandigheden. ²⁸ Beide sondes zijn ook ratiometrische. Dientengevolge, worden de metingen die met deze probes niet door change's in biosensor concentratie of monster verlichting of de dikte. Tot slot, zowel biosensoren bieden subcellular ruimtelijke resolutie. Inderdaad, roGFP is gericht op mitochondria, ER, endosomen en peroxisomen ²⁴ en kan detecteren veranderingen in redox status van elk van deze organellen, grotendeels onafhankelijk van de pH.

Protocol

1. Transformatie van gistcellen de Biosensoren Transformeren de gewenste giststam met plasmide dragende mito-roGFP of mitGO-ATeam2 met de lithiumacetaat methode 27. Om transformatie te bevestigen met het plasmide gedragen biosensor en tot verlies van het plasmide voorkomen, selecteert en transformanten op het geschikte selectieve synthetische compleet medium (SC-Ura voor mito-roGFP of SC-Leu voor mitGo-ATeam2) te behouden. Als de fluorescente probe werd gesubkloneerd in een ander plasmide…

Representative Results

Het meten van mitochondriale redox staat met mito-roGFP Hier laten we zien dat mito-roGFP1 heeft het dynamische bereik van veranderingen in mitochondriale redox toestand detecteren van volledig geoxideerd tot gereduceerd levende gistcellen, zonder de gist celgroei of mitochondriale morfologie. Ten eerste, vinden we cellen die mitochondria-gerichte GFP en roGFP1 groeien in normale tarieven (Figuur 1A). De maximale groeisnelheid, zoals gemeten door de maximale helling van de groe…

Discussion

Hier beschrijven we methoden om mito-roGFP1 en mitGO-ATeam2 gebruiken als biosensoren om mitochondriale redox staat en ATP-niveau te beoordelen in levende gistcellen. Wij vinden dat de expressie van plasmide gedragen mito-roGFP1 of mitGO-ATeam resultaten in kwantitatieve doelstelling voor mitochondria, zonder enig duidelijk effect op de mitochondriale morfologie of distributie of op de cellulaire groei. ³ Mito-roGFP1 kan detecteren veranderingen in de mitochondriale redox toestand van zeer geoxideerd tot ster…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/