Yaşam Maya Hücreleri Mitokondriyal Redoks Devlet ve ATP ölçün oranlı metrik Biyosensörler
Summary
Biz canlı maya hücrelerinde hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini izlemek için, GFP temel alan iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör, kullanımı açıklanmaktadır.
Abstract
Mitokondri enerji metabolizması ve hücre ömrü ve programlanmış hücre ölümü kontrol etmek için kalsiyum homeostazı, birçok hücresel süreçlerde rol oynarlar. Bu süreçler etkiler ve redoks durumu ve mitokondri tarafından ATP üretimi etkilenir. Burada, maya hücreleri canlı hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeyini algılar iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör kullanımını tarif. Mitokondriyal redoks devlet mitokondrial matriks hedeflenmektedir redoks duyarlı Yeşil floresan proteini (roGFP) kullanılarak ölçülür. Mito-roGFP da protein uyarma spektrumu değiştirebilir geri ve çevre-bağımlı oksidasyon ve redüksiyon, tabi pozisyonlar 147 ve GFP 204, de sistein içerir. MitGO-ATeam F o ε altbirim F 1-ATP sentetaz arasına sıkıştırılmış olduğu bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) probu, donör ve alıcı Fluo FRETrescent proteinler. Getirmek protein konformasyonunun olarak ε altbirim sonuçlarına ATP bağlama yakın verici ve alıcı ve verici FRET gelen alıcı için floresans rezonans enerji transferi için izin verir.
Introduction
Mitokondri amino asitler, yağlı asitler, heme, demir sülfür, kümeleri ve pirimidinlerin ATP üretimi, biyosentezi için gerekli organellerdir. Mitokondri de kalsiyum dengesinin önemli rol oynarlar ve apoptoz düzenlenmesinde. Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı, Amyotrofik lateral skleroz ve Huntington hastalığı gibi yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıklara mitokondri Artan 1 kanıt bağlantılar. 2 kişi ile bütün hayatlarını yaşarken nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili protein, mitokondriyal mutasyonlar, hastalık semptomları ileri yaşlarda ortaya çıkar. Bu değişiklikler ortaya hastalık patolojisi izin yaşla birlikte mitokondri meydana gösterir. Gerçekten de, mitokondriyal spor genel hücre sağlığı ve ömrü maya ve memeli hücreleri ile ilişkilidir. Burada 3,4, biz mitoc iki kritik özellikleri değerlendirmek için genetik olarak kodlanmış, rasyometrik floresan biyosensörler nasıl kullanılacağı açıklanmaktadırmaya hücreleri canlı hondria: redoks devlet ve ATP seviyeleri.
Aerobik enerji seferberlik içinde mitokondriyal fonksiyonu iyi bilinmektedir. Mitokondriyal redoks devlet NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutatyon / glutatyon disülfit (GSH / GSSG) ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) dahil olmak üzere, organel türlerin azaltılması ve oksitleyici bir ürünüdür. Mitokondri veya hipoksi ayrılması mitokondriyal solunum faaliyeti etkiler ve NAD oranı + organelde NADH için değiştirir. Iç mitokondriyal zarın bir elektron nakil zincirinin kompleksleri, hem de aminlerin deaminasyon gelen dış mitokondriyal membranın monoamin oksidaz ile 5, hasar lipidler, proteinler ve nükleik asitler arasındaki yetersiz elektron transferinden imal edilmiştir ve ROS 6,7,8 yaşlanma ve yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. ROS, aynı zamanda m sinyal transdüksiyonu bir rol oynayabiliritochondria, GSH oksidasyonu ile. Örneğin, NADH dehidrogenaz ROS üretimine katkıda değil, aynı zamanda glutatyon havuzu 9,10 ile etkileşim yoluyla düzenlenir. α-Ketoglutarat dehidrogenaz ve asonitaz, TCA döngüsü bileşenleri, ortamlar 11,12 oksitleyici azalmış aktivite gösterirler.
Gerçekten de, asonitaz faaliyet redoks bağımlı düzenleme bakterilerden memelilere 13,14 için korunur. Böylece, redoks devlet ve mitokondri ATP seviyeleri izleme hastalığı patoloji kendi işlevini ve rolünü anlamak için çok önemlidir.
Biyokimyasal yöntemler redoks devlet veya tüm hücrelerin ATP düzeylerini değerlendirmek için kullanılan ya da mitokondri izole edilmiştir. Bütün hücrelerde ya da redoks durumunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan yöntemler mitokondri izole redoks çifti GSH / GSSG 15 seviyelerinin ölçülmesi dayanmaktadır. Lusiferin-lusiferaz sistemi yaygın mitokondriyal ölçmek için kullanılırMitokondri permeabilize bütün hücreler veya izole edilmiş ya da ATP seviyeleri. 16,17,18,19,20 Bu deneyde, lusiferaz orantılıdır ATP ye bağlanan ve oksitlenmesi ve luciferase ikinci kemilüminesans katalize eder. 21 yayılan ışık şiddeti Reaksiyon karışımı, ATP. 22
Bu yöntemler, örneğin Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, anormal derecede düşük olan hastalarda ATP seviyeleri bulgu da dahil olmak üzere, mitokondriyal fonksiyonu, ilgili temel bilgiler ortaya konmuştur. 23 Bununla birlikte, görüntü canlı, sağlam hücreler için kullanılamaz. Ayrıca, tüm-hücre analizine dayalı yöntemler redoks durumu ya da hücrenin tüm bölümlerinde ATP seviyelerinin bir ortalaması sağlar. Mitokondriyal redoks devlet veya ATP seviyeleri hücre içi fraksiyon sırasında değişebilir çünkü izole organeller ölçümler potansiyel sorunlu. Son olarak, laboratuar ve diğerlerinden son çalışmalar gösteriyor kitek tek hücreler içinde mitokondri da anne ve yavru hücrelerin ömrünü etkiler, fonksiyon heterojendir. 3 Bu nedenle, hücre içi çözünürlüğe sahip canlı hücrelerde mitokondriyal ATP seviyeleri ve redoks ölçmek için bir ihtiyaç vardır.
Her iki GFP dayalı mitokondriyal fonksiyon için biyosensör Burada anlatılan. Redoks-duyarlı GFP (roGFP) 24,25 yüzeye maruz kalan sisteinler molekülüne ilave edildiği bir GFP çeşididir. roGFP, yabani tip GFP gibi, iki uyarma tepeler (~ 400 nm ve 480 nm 'de ~) ve ~ 510 nm'de emisyon tepe vardır. ~ 400 nm'de eksitasyon artışa roGFP sonuçlarında sistein kalıntıları oksidasyonu. Bu sistein azaltılması ~ 480 nm uyarma yanadır. Böylece, 480 nm ve 400 nm dalga boyunda roGFP uyarma üzerine 510 nm emisyon oranı fluorofor en ortamının redoks durumunu yansıtan azalır ve okside roGFP, göreli miktarını ortaya koymaktadır.
İki versroGFP iyonları yaygın olarak kullanılır: roGFP1 ve roGFP2. Her ikisi de aynı sistein eklemeleri içerir. roGFP1 yabani tip GFP esas alınmaktadır ve roGFP2 wtGFP 24 göre 400 nm ile 480 nm ve daha az etkili bir uyarma daha verimli bir uyarım var S65T GFP esas alınmaktadır. roGFP1 roGFP2 ve dinamik aralığı düşük bir kapsama alanı içine daha fazla genişletir daha duyarlı daha az pH olduğunu. Böylece, roGFP1 daha azaltılması gibi mitokondri gibi bölmeleri veya sitoplazmada ve bu endozomlar gibi değişken pH, ile bölmeleri izlenmesi için daha yararlı olabilir. roGFP2 parlak sinyal ve, bazı çalışmalarda, roGFP1 24,26 daha büyük bir dinamik aralık sunuyor. Arabidopsis thaliana çalışmalar redoks değişikliklere yanıt için gereken zaman her iki sensörden (t ½ oksidasyonu için, 65 ve 95 sn ve t ½, sırasıyla roGFP1 ve roGFP2 için azaltılması, 272 ve 206 saniye,) için benzer olduğunu gösterir. 26
MitGO-ATeam2 minimal invaziv, güvenilirtomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae mitokondriyal ATP ölçer sensör. GO-ATeam donör ve alıcı floresan proteinleri (GFP ve turuncu (OFP) protein floresan, sırasıyla) FRET F o arasında sıkışmış F 1-ATP sentaz ε alt birimi oluşan bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) prob. 27 getirmek proteinin konformasyonel değişiklikler ε altbirim sonuçlarına ATP bağlama alıcı yakın FRET donör ve alıcı vericiden enerji transferini sağlar. GO-ATeam, GO-ATeam1 ve GO-ATeam2 iki türevleri vardır. GO-ATeam2 genellikle daha düşük mitokondride sitoplazmada karşılaştırılmıştır [ATP]. 27 ölçüm için daha uygun hale GO-ATeam1 daha MgATP için daha yüksek bir afiniteye sahiptir
Mitokondriyal redoks araştırmak için, bir lider dizisi ATP9 kaynaşmış roGFP1 oluşan bir füzyon proteini (mito-roGFP1) inşand güçlü gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (gpd) promoteri (p416GPD, Addgene) kontrolü altında, bir sentromer plazmid bazlı (düşük kopya sayısı) maya ekspresyon eksprese. Bu model mantar, Saccharomyces cerevisiae yaşlanma bağlamında mitokondri redoks statüsü araştırmak için kullanılan roGFP1. Biz roGFP1 yaşlanma sırasında ve besin durumu tepki olarak ortaya ama maya hücreleri üzerinde belirgin bir olumsuz etki yapar mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri algılamak bulabilirsiniz. Biz de tek tek canlı maya hücrelerinin içinde mitokondri redoks durumu değişkenlik, hücre içi mekansal çözünürlükte bir biyosensör önemini vurguluyor bir bulgu bakın.
MitGO-ATeam2 GO-ATeam2 en amino ucunda takılı sitokrom c oksidaz alt ünite VIIIA en mitokondriyal sinyal dizisi vardır GO-ATeam2, bir çeşididir. 27 Biz mitGO-ATeam2 prob (lütfen H. laboratuvar tarafından sağlanan modifiye Noji, Enstitüsü of Bilimsel ve düşük kopya plazmid olan maya ifade vektörü pAG415GPD-ccdb (Addgene, Cambridge, MA, USA) içine Xba1 ve HindIII bölgeleri yoluyla alt klonlama ile Mayada kullanım için endüstriyel araştırma, Osaka Üniversitesi, Japonya), güçlü kurucu GPD organizatörü içeren. Biz tomurcuklanan maya mitGO-ATeam2 ifade ve mitokondriyal ATP düzeylerinde fizyolojik değişiklikleri ölçmek için etkili bir prob olarak hizmet vermektedir bu mitokondri için sadece lokalize DNA bağlayıcı boya DAPI,, ile counterstaining tarafından, bulabilirsiniz.
roGFP ve GO-ATeam genetik olarak kodlanmış her ikisi de. Sonuç olarak, ortaya ve sabit bir şekilde tutulmuş sağlam hücreler ve redoks durumu ya da tek tek, canlı hücrelerdeki ATP seviyeleri hakkında bilgi alınabilir. Ayrıca, her iki biyosensör fizyolojik koşullar altında redoks devlet veya meydana ATP seviyelerinde değişiklikleri izlemek. 28 Her iki prob da rasyometrik bulunmaktadır. Bunun sonucu olarak, bu sonda ile yapılan ölçümler Cha etkilenmezbiyosensör konsantrasyon veya numune aydınlatma veya kalınlığında nges. Son olarak, her iki biyosensör hücre içi uzaysal çözünürlüğü sağlar. Gerçekten de, roGFP mitokondri, ER için hedeflenmiştir, endozomlar ve 24 peroksizomlar, ve pH büyük ölçüde bağımsız Bu parçaların her birinin redoks durumu değişiklikleri, algılayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, maya hücreleri canlı mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini değerlendirmek için biyosensör olarak mito-roGFP1 ve mitGO-ATeam2 kullanımı yöntemleri açıklanmaktadır. Biz nicel mitokondriyal morfolojisi veya dağıtım veya hücresel büyüme oranları üzerinde herhangi bir belirgin etki olmadan, mitokondri için hedef olarak plazmid kaynaklı mito-roGFP1 veya mitGO-ATeam sonuçlarının bu ifade bulabilirsiniz. 3 Mito-roGFP1 yüksek gelen mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma HHMI 56006760 dan (GM45735, JDV, DMAW için Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) (2 1 TL RR 24.158-6), ve Ellison Tıp Vakfı (AG-SS-2.465) ve NIH ödül tarafından desteklenen GM45735S1 ve GM096445) LP. GM45735S1 Amerikan Kurtarma ve yeniden yatırım Yasası 2009 altında NIH yayınlandı. Bu çalışmalar için kullanılan mikroskoplar bir NIH / NCI hibe (5 P30 CA13696) ile kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Reagents | |||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution. |
| SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
| SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
| Valap | Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin |
||
| Equipment and Software | |||
| Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm |
| High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance |
| Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm) |
| A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective | Nikon (Melville, NY) | ||
| AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software | Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan) | ||
| Volocity 3D Image Analysis software | Perkin Elmer (Waltham, MA) | Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement | |
| ImageJ software | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Referências
- Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
- Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
- Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).
- Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
- Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).
- Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).
- Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).
- Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).
- Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).
- Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).
- Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
- Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
- Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
- Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
- Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
- Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).
- DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
- Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer’s disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
- Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).
- Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).
- Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).
- Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. , 45-57 (2006).
