正向遗传途径<em>沙眼衣原体</em
Summary
我们描述了一种方法来进行遗传分析化学诱变和全基因组测序的基础上衣原体 。此外，感染细胞内的DNA交换系统可用于遗传作图描述。此方法可广泛适用于微生物系统，缺乏改造系统和分子遗传工具。
Abstract
沙眼衣原体 ，性病和眼部感染的病原体，仍然差的特点，由于其难解实验转型与重组DNA。我们开发了一种方法来进行遗传分析，C.尽管缺乏分子遗传工具衣原体 。我们的方法包括：）。化学诱变快速生成全面定义基因的突变体库，具有不同表型，II。）全基因组测序（WGS）映射潜在的遗传病变，找到突变基因（S）之间的关联一个共同的表型; III）代重组菌株通过哺乳动物细胞突变体和野生型细菌感染的合作。因此，我们能够建立基因型和表现型之间的因果关系。耦合化学诱导的基因变异与WGS建立相关的基因型 – 表型关联寿LD是广泛适用于大名单，医疗和环境重要的微生物，目前棘手的遗传分析。
Introduction
有一个独特的专性细胞内细菌沙眼衣原体占估计有280万生殖道感染，每年在美国（疾病控制中心），相关的后遗症，如盆腔炎，异位妊娠，不孕不育（1） 衣原体属生理发育周期的两相组成的两种形式：感染性但非复制生小体（EB）和非感染性的，但复制的网状体（RB）。感染开始，随后者endoctyotosis（2）的上皮细胞的胚体附件。称为膜结合液泡内夹杂物，EBS分化成RB形式，然后复制二进制裂变的。时周期中，资源块的转换回成胚体，然后将其排出到细胞外空间，开始新一轮的感染的宿主细胞裂解（3）。
沙眼衣原体是难治性标准的分子遗传工具，如针对性的基因置换，转座子，转导噬菌体，大多数细菌遗传学的研究中心一直与常规操作，目前还不清楚在何种程度上个别衣原体基因有助于先天免疫逃避的，营养的收购，发育的过渡，或其他进程在真核宿主（4）重要的病原体的生存。因此，这种病原体仍然很差的特点，尽管其临床重要性。
衣原体菌的基因组。都比较小（〜1 MB）（5）采用新一代测序技术测序的多个物种和生物型。比较基因组分析由WGS衣原体种的演变，并使其适应人类（6-8），并在一定程度上提供了独特的见解，提供了一些有关的潜在的毒力因子的功能（9，10）。 Ť他显示临床分离株的遗传多样性并不提供系统最毒力因子的功能映射所需的分辨率，这大概是因为在这样的基因的突变会被容易地选择反对。如果没有从自然选择，诱变诱发的基因变异，加上有明确的检测措施缺陷致病，可扩展的突变谱，可以调查的混杂影响。化学诱变剂，尤其是有用的，因为它们可以产生空的，有条件的，减少亚效等位基因（功能），和hypermorphic（增益函数）等位基因。随着功能强大的下一代基因组测序技术的到来，这种突变可以很容易地识别和映射。以这种方式，可以强关联之间的突变的基因或遗传途径和一个共同的表型，使正向遗传学的方法中的应用。
临床分离株的基因组序列的嵌合透露between血清型和频繁的重组位点（11）。重组的实证证据证明，通过共同感染两种不同的抗生素有抗药性的菌株和选择双抗重组的后代，这是显露有两种菌株的遗传贡献（12，13）。因此，在一个共同感染的设置的野生型和突变株之间的遗传交换允许针对受影响的偏析化学诱导突变导致所观察到的表型的基因，该基因。
这里，我们描述了一种方法来执行衣原体基因分析在化学诱变，WGS感染细胞内的DNA交换（14）（ 图1），以及系统的基础上的。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种方法符合遗传分析的基本要求，因为它建立了基因型和表现型之间的联动。重要的是，这是实现不借助常规的分子工具的重组DNA转化的插入失活的基因在细菌中，这通常是在非模型的微生物的基因的功能分析的限速步骤。
一个关键的步骤是，以确保克隆的噬菌斑纯化的突变体。与野生型或突变“钳工”的交叉污染，可以迅速导致突变株被outcompeted。同样，测绘非克隆样本…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
Referências
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