O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada pela In situ Hibridação. Nosso protocolo melhorado permite a detecção de transcritos abundantes de baixo com baixo sinal de fundo não específico.
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Artigo de método
Alta resolução Monte Whole
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este artigo incide sobre todo o monte de hibridização in situ (desejo) de embriões de peixe-zebra. A tecnologia VONTADE facilita a avaliação da expressão do gene, tanto em termos de distribuição do tecido e fase de desenvolvimento. Protocolos são descritas pela utilização de desejo dos embriões de peixe-zebra utilizando sondas de ARN anti-sentido marcadas com digoxigenina. As sondas são gerados através da incorporação de nucleótidos ligados com digoxigenina, através de transcrição in vitro de modelos de genes que foram clonados e linearizado. Os córions de embriões colhidos em estádios de desenvolvimento definidos são removidos antes da incubação com sondas específicas. Seguindo um processo de lavagem para remover o excesso de sonda, os embriões foram incubados com o anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina. Com o emprego de um substrato cromogénico para a fosfatase alcalina, a expressão do gene específico pode ser avaliada. Dependendo do nível de expressão do gene de todo o processo pode ser completado dentro de 2-3 dias.
Introdução
O peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um poderoso modelo animal para o estudo do desenvolvimento dos vertebrados, a doença, o comportamento e no rastreio de drogas 1-3. Embriões de peixe-zebra pode ser obtido em grandes quantidades a partir de um único cruzamento. Fertilização e desenvolvimento ocorre ex utero e os embriões opticamente claras desenvolver rapidamente. Eventos críticos de desenvolvimento ocorrem durante as primeiras 48 horas pós-fertilização (hpf). Isto inclui o aparecimento de órgão primórdios e o início de citodiferenciação. Knockdown ou sobre-expressão de proteínas pode ser alcançada através da microinjecção de e....
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Protocolo
1. Todo-mount Hibridização In Situ de embriões Zebrafish
1.1 Preparação de Embriões
- Coletar embriões em estágios de desenvolvimento necessários. Por favor, veja Kimmel et al. 5 para descrição estágio embrionário.
- Remover córions manualmente usando uma pinça (Dumont Relojoeiros Fórceps não. 5).
- Fix embriões em uma solução a 4% de paraformaldeído (PFA), composto em PBS (Tampão fosfato salino) durante a noite a 4 ° C.
- Lavar embriões com PBS, pelo menos 3 x durante 5 min cada, à temperatura ambiente.
- Loja embriões em 100% de metanol (MeOH) ....
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Resultados
Usando o protocolo com 50 embriões por cesto (por gene de / por condição experimental), o padrão de expressão do gene, que podem ser obtidos numa experiência. Quase todos os embriões mostram padrões de expressão semelhantes para um determinado gene. Os exemplos representativos da coloração em hibridação in situ são mostrados nas Figuras 3-6.
Tanto o sentido e anti-sentido riboprobes foram sintetizados a partir dos cDNAs correspondentes a PC5.1, PC5.2 6.......
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Discussão
Nós desenvolvemos métodos melhorados para visualizar o RNA com alta resolução. A nos procedimentos de hibridização in situ são realizados através de simples cestos feitos sob medida com fundo poroso (Figura 1). Os embriões são processadas usando soluções sem RNase em placas de 6 cavidades, à temperatura ambiente e sob condições estéreis.
Segregar embriões cestas são feitas de diferentes tubos coloridos Eppendorf. Cestas com ou sem um aro são utilizados para.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA - Promotor duplo pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Kit de purificação de plasmídeo | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 e HindIII Enzimas de restrição | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Tampão Saturado Fenol, | Invitrogen | 15513039 | Armazenar a 4 °C. Olhos, pele e trato respiratório irritantes e suspeitos de serem cancerígenos. Deve-se ter cuidado durante o manuseio. |
| Clorofórmio | Fisher | C607-1 | Tóxico e suspeito de ser cancerígeno. Trabalhe sob a coifa. |
| DNAse livre de RNase I | Roche | 4716728001 | Prepare pequenas alíquotas e armazene a -20 graus C. |
| Mistura de marcação de DIG-RNA com Sp6, T7 e T3 RNA polimerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Acetato de sódio (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Etanol | Álcoois | ||
| Dietil Pirocarbonato (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | O DEPC é um irritante para os olhos, a pele e as vias respiratórias. Evite o contato com a pele e os olhos. Use óculos de segurança, luvas e máscara. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0,5 M (pH 8,0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Sistemas de Aquário de Sal Oceânico Instantâneo | N/A | ||
| Fosfato Tampolado Salino (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldeído (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare e armazene a -20 graus; C em alíquotas de 40 ml para utilização posterior. O PFA é tóxico. Use óculos de segurança, luvas e máscara contra poeira. |
| Feniltiocarbomida (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC é altamente tóxico. Use óculos de segurança, luvas e máscara contra poeira. |
| Metanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Relojoeiro s) Padrão de pinça nº 5 | Fine Science Tools | ||
| Cluster de cultura de células de seis poços | Sarstedt | 83.1839 | |
| Os cestos são feitos de malha de nylon e tubos Eppendorf | Preparação | Para fazer os cestos, corte tubos Eppendorf (1,5 ml) com ou sem bordas para remover a extremidade cônica. Corte a malha de nylon em pequenos pedaços correspondentes ao tamanho de as extremidades cortadas dos tubos Eppendorf. Coloque os tubos com a malha de nylon cobrindo a extremidade cortada em um elétrico placa quente até que o tubo e a malha de nylon fiquem juntos (realize na capela de exaustão). Corte o excesso de malha dos cestos e guarde-os em 100% de metanol até o uso. | |
| Monolaurato de polioxietilenoorbitano (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Anidrido acético | Sigma | 242845 | |
| Trietanolamina | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamida, grau de pureza alta | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resina | Bio Rad | 142-6424 | |
| ácido cítrico monohidratado | Sigma | C0706-500G | |
| sal de heparina sódica | Sigma | H3393-25KU | |
| tampão de citrato de sódio salino (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA de levedura de padeiro tipo X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Cloridrato de Levamisol | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimetilformamida anidro (DMF) | Sigma | 227056 | Teratógeno irritante, tóxico, combustível e suspeito. Manuseie com trajes de segurança adequados, incluindo luvas e óculos de proteção. |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) | Sigma | N6639 | Proteger esta solução da luz. |
| Nitroblue tetrazólio (NBT) | Sigma | 840W | Proteja esta solução da luz. |
| Albumina de soro bovino, fração purificada V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Fragmentos de Fab Anti-digoxigenina-AP de ovelha | Roche | 1093274910 | |
| Glicerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Placas de cultura de células de 96 poços | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg (mnx1: GFP) ml2 / Tg (hb9: GFP) ml2 | ZIRC | Tg (mnx1: GFP) ml2 | |
| Sistemas de aquário oceânico instantâneo | N / A |
Referências
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
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Reimpressões e permissões
