Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel
Summary
Schetsen we methoden voor de efficiënte en snelle isolatie / cultuur van levensvatbare microglia uit de neonatale cerebrale cortex en volwassen ruggenmerg. De dissectie en beplating van corticale microglia kan worden bereikt binnen 90 minuten, met de daaropvolgende microglia oogst plaatsvindt ~ 10 dagen na de eerste dissectie.
Abstract
Microglia vormen de resident macrofaag-achtige cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en, als zodanig, zijn kritisch belangrijke rol in fysiologische en pathologische processen zoals CNS rijping in ontwikkeling, multiple sclerose en ruggenmergletsel. Microglia kan worden geactiveerd en aangeworven om actie van neuronale verwonding of stimulatie, zoals axonale schade gezien in MS of ischemische hersentrauma als gevolg van een beroerte. Deze immunocompetente leden van het CZS zijn ook gedacht aan rollen in synaptische plasticiteit onder niet-pathologische omstandigheden. We gebruiken protocollen voor het kweken microglia van de neonatale en volwassen weefsels die bedoeld zijn om het aantal levensvatbare cellen te maximaliseren terwijl het minimaliseren verstorende variabelen, zoals de aanwezigheid van andere CNS celtypes en celkweek vuil. We maken gebruik van grote en duidelijk herkenbaar CNS componenten (bijv. cortex, ruggenmergsegmenten), die het gehele proces haalbaar en reproduceerbaar maakt. Het gebruik van volwassen cels is een geschikt alternatief voor het gebruik van neonatale hersenen microglia, zoals veel ziekten bestudeerde vooral invloed de postnatale ruggenmerg. Deze kweeksystemen zijn ook bruikbaar voor het effect van verbindingen die ofwel kunnen remmen of bevorderen microgliale activering direct testen. Aangezien microgliale activering de resultaten van ziekte kan vormen in het volwassen CZS, is er een behoefte in vitro systemen waarin neonatale en volwassen microglia kunnen worden gekweekt en onderzocht.
Introduction
Microglia vormen de bewoner immune cellen van het CNS, de meeste overeenkomst vertonen perifere macrofagen in structuur en functie 1. Het is onlangs aangetoond dat postnatale microgliale cellen afkomstig uit primitieve myeloïde progenitoren en worden gegenereerd voordat de achtste embryogenese, upending de vorige idee dat postnatale hematopoietische voorlopers zijn de bron van microglia in de volwassen hersenen 2. Zij spelen belangrijke rollen in verscheidene neurologische ziekten en kunnen snel inspelen op infectie of letsel door het vrijgeven van pro-inflammatoire of anti-inflammatoire cytokines 3. Aldus omvatten microglia een zelfstandige eenheid in het CZS kan worden gemanipuleerd ziekteprogressie beïnvloeden. Ontwikkelen van robuuste, reproduceerbare methoden het isoleren en kweken neonatale of volwassen microgliale cellen belangrijk voor toekomstige studies.
Microglia is bekend kritisch spelers in een aantal hersenen pathologieën. Recenter roles zijn in opkomst voor de cellen in de normale ontwikkeling van de hersenen en de functie als microglia fagocyteren overtollige neurale stamcellen uit de dentate gyrus van de hippocampus 1, 4. Microglia kan ook moduleren verschillende neurologische aandoeningen die het ruggenmerg beïnvloeden, zoals MS, neuropathische pijn, en dwarslaesie 5-7. Ruggenmerg microglia reageren verschillend tegenover hersenen microglia in response op activering signalen 8, 9, waarschijnlijk als gevolg van verschillen in de lokale omgeving. Dus is het belangrijk een geschikte stand in vitro systeem voor cultuur en studie ruggenmerg microglia. Neonatale microglia tot significant meer van de pro-inflammatoire cytokine stikstofoxide dan bij volwassen cellen na in vitro stimulatie met IFN-γ en TNF-a 10,11 verder benadrukt dat volwassen cellen gebruiken om microglia bestuderen in de context van bepaalde ziekten.
Het protocol we gebruiken in het lab te culture neonatale microglia is een variant van recente methoden die gebruik schudden van gemengde gliale culturen in een poging om de microglia van het oppervlak van de celkweek kolf 12 verwijderen. Ook beschrijven we een methode om cultuur microglia van de volwassen muis ruggenmerg gebaseerd op een protocol eerst beschreven door Yip, et al. 13. Deze methode levert een snellere manier om de cultuur volwassen cellen in vergelijking met andere beschikbare protocollen 14. De resulterende voorbereiding is 70% microglia, de overige percentage bestaat uit astrocyten. Hoewel de zuiverheid van onze cultuur is lager in vergelijking met andere gepubliceerde methoden 13, dit kweeksysteem is nuttig voor het verkennen van microglia in kweek reactie op diverse activerende stimuli en voor de studie van ziekten die vooral invloed het ruggenmerg en die een sterke ontstekingsreactie is een van de hoofdkenmerken.
Al de beschreven protocollen zijn goedgekeurd door de Stony Brook University IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia moduleren CNS normale werking en ontstekingsreacties verschillende pathologieën. Functionele synaptische remodeling door microglia is betrokken bij het handhaven van normale hersenen homeostase 15. Tijdens de neurogene cascade zij deelnemen aan de klaring van neurale stamcellen uit de dentate gyrus van de hippocampus 4, 16. Daarom is het noodzakelijk om een kweeksysteem waarin neonatale en volwassen microglia, waarvan de grote strook van en volwassen, gedurende welke microgli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de leden van de Tsirka lab bedanken voor hun advies en behulpzaam opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door R01NS42168 naar SET, 12PRE12060489 aan RB, een NSF-3MT IGERT en een Turner Proefschrift fellowship aan LT, en NSF-3MT IGERT te JCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
Referências
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer’s disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation – tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
