Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System
Summary
Wir skizzieren Methoden für die effiziente und schnelle Isolierung / Kultur lebensfähiger Mikroglia aus dem Neugeborenen Hirnrinde und erwachsenen Rückenmark. Die Präparation und Beschichtung der kortikalen Mikroglia kann innerhalb von 90 Minuten erreicht werden, mit der anschließenden Mikroglia Ernte stattfindet ~ 10 Tage nach der ersten Sektion.
Abstract
Mikroglia sind die ansässigen Makrophagen-ähnlichen Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) und als solche haben kritisch wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen wie CNS Reifung in der Entwicklung, Multiple Sklerose und Rückenmarksverletzungen. Mikrogliazellen aktiviert und rekrutiert zum Handeln durch neuronale Verletzungen oder Stimulation, wie axonalen Schäden in MS oder ischämischer Hirn-Trauma von Schlaganfällen gesehen. Diese immunkompetenten Mitglieder des ZNS sind auch gedacht, um Rollen in synaptische Plastizität unter nicht-pathologischen Bedingungen haben. Wir beschäftigen Protokolle für die Kultivierung Mikroglia von den Neugeborenen und Erwachsenen Gewebe, die das Ziel, die Anzahl lebender Zellen zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Störvariablen, wie das Vorhandensein von anderen ZNS Zelltypen und Zellkultur Trümmer sind. Wir nutzen große und leicht erkennbare CNS Komponenten (zB Cortex, Rückenmark Segmente), die den gesamten Prozess durchführbar und reproduzierbar macht. Die Verwendung von adulten Zelles ist eine geeignete Alternative zur Verwendung von neonatalen Gehirn Mikroglia, da viele Erkrankungen betreffen hauptsächlich untersuchten die postnatale Rückenmark. Diese Kultur Systeme eignen sich auch zur direkten Prüfung der Wirkung von Verbindungen, die entweder hemmen oder fördern Mikroglia-Aktivierung kann. Da Mikroglia-Aktivierung kann die Ergebnisse der Krankheit in adulten ZNS gestalten, gibt es einen Bedarf für in-vitro-Systemen in der Neugeborenen und Erwachsenen Mikroglia gezüchtet und untersucht werden können.
Introduction
Mikroglia sind die Immunzellen Bewohner des ZNS, am ähnlichsten peripheren Makrophagen in Struktur und Funktion 1. Es wurde kürzlich gezeigt, dass postnatale Mikrogliazellen von primitiven myeloischen Vorläuferzellen ableiten und vor dem achten Tag der Embryogenese erzeugt, Hochkantstellen die bisherige Vorstellung, dass postnatale hämatopoetischen Vorläuferzellen die Quelle der Mikroglia im adulten Gehirn 2 sind. Sie spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen neurologischen Erkrankungen und können schnell zu Infektionen oder Verletzungen reagieren durch Freisetzung pro-inflammatorische oder anti-inflammatorische Zytokine 3. So Mikroglia umfassen ein Standgerät im ZNS, die manipuliert, um den Krankheitsverlauf beeinflussen kann. Die Entwicklung von soliden und reproduzierbare Methoden zur Isolierung und Kultur Neugeborenen oder Erwachsenen Mikrogliazellen ist wichtig, um zukünftige Studien.
Mikroglia sind bekanntermaßen kritisch Spieler in einer Reihe von Hirnerkrankungen sein. In jüngerer Zeit roles sind für die Zellen in normale Entwicklung des Gehirns und fungieren als Mikroglia Phagozytose überschüssige neuronale Vorläuferzellen aus dem Gyrus dentatus des Hippocampus 1, 4 entstehen. Mikroglia modulieren können auch mehrere neurologischen Erkrankungen, die das Rückenmark betreffen, wie z. B. MS, neuropathische Schmerzen und Verletzungen des Rückenmarks 5-7. Rückenmark Mikroglia reagieren unterschiedlich gegenüber Gehirn Mikroglia in Reaktion auf Ansteuersignale 8, 9, vermutlich aufgrund der Unterschiede in der lokalen Umgebung. Daher ist es wichtig, eine geeignete in vitro System, um Kultur und studieren Rückenmark Mikroglia. Neonatal Mikroglia produzieren deutlich mehr von der pro-inflammatorische Zytokin Stickstoffmonoxid im Vergleich zu erwachsenen Zellen nach in vitro Stimulation mit IFN-γ oder TNF-a 10,11 weiter hervorgehoben wird, dass adulte Zellen verwenden, um Mikroglia im Rahmen von bestimmten Krankheiten zu studieren.
Das Protokoll beschäftigen wir im Labor auf culture Neugeborenen Mikroglia ist eine Variante des letzten Methoden Schütteln gemischt Gliakulturen in dem Bemühen, die Mikroglia der Oberfläche der Zellkulturflasche 12 entfernen zu nutzen. Wir beschreiben auch ein Verfahren zur Kultur von Mikroglia der adulten Maus Rückenmark über ein Protokoll zuerst von Yip et al 13 beschrieben ist. Diese Methode bietet einen schnelleren Weg zur Kultur adulter Zellen im Vergleich zu anderen verfügbaren Protokolle 14. Das erhaltene Präparat beträgt 70% Mikroglia, die restlichen Prozentsatz wird von Astrozyten zusammen. Obwohl die Reinheit der Kultur ist niedriger im Vergleich zu anderen veröffentlichten Verfahren 13 ist dieses Kultursystem zur Erkundung der Mikroglia in Kultur als Antwort auf verschiedene aktivierende Stimuli sowie zur Untersuchung von Krankheiten, die hauptsächlich im Bereich des Rückenmarks und nützlich, in denen ein starker Entzündungsreaktion ist ein Hauptmerkmal.
Alle beschriebenen Protokolle wurden von der Stony Brook Universi genehmigtty IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia modulieren CNS normale Funktionieren sowie Entzündungsreaktionen zu verschiedenen Pathologien. Functional synaptischen Umbau von Mikroglia in der Aufrechterhaltung des normalen Gehirn Homöostase 15 in Verbindung gebracht. Während der neurogenen Kaskade sie beteiligen sich an der Clearance von neuralen Vorläuferzellen aus dem Gyrus dentatus des Hippocampus 4, 16. Daher ist es notwendig, eine Kultur, bei dem Neugeborenen und Erwachsenen Mikroglia, die die große Schwade der Entwicklung …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten den Mitgliedern des Tsirka Labor für ihre Ratschläge und hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde von R01NS42168 unterstützt auf SET, um 12PRE12060489 RB, einer NSF-3MT IGERT und Turner Dissertation Stipendium für LT und NSF-3MT IGERT zu JCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
Referências
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