배아 배양하는 방법<em> C. 엘레</em> 셀
Summary
우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.
Abstract
C. elegans의 유전 및 분자 기술에 쉽게 적용되는 강력한 모델 시스템이다. 최근까지, 비록 세포와 특정 세포 유형의 분리에 대한 직접 액세스를 요구하는 기술은, C.에 적용 할 수 없었다 엘레. 이 제한은 조직이 쉽게 효소 및 / 또는 세제로 처리하여 분해되지 않은 가압 표피 내에 국한된다는 사실 때문이었다. 레어드 꽃, 크리스텐슨과 1 C.을 배양하기위한 강력한 방법을 개발 동료에 의해 초기 개척자의 작업을 바탕으로 큰 규모의 배아 세포 엘레 간스. 계란은 표백제 / NaOH로 처리하여 임신하는 성인에서 분리하고 이후에 달걀 껍질을 제거하는 키틴으로 처리됩니다. 배아 세포는 다음 수동 피펫에 의해 해리와 혈청 풍부한 미디어 기판 덮인 유리에 도금되어있다. 아이솔레이션 셀 24 시간 이내에 형태를 변화시킴으로써 세포를 발현하는 특정 마르크 의해 구별하기 시작할RS. C. 엘레이 방법을 사용하여 배양 된 세포는 체외에서 2 주까지 생존 및 전기 생리학, 면역에 사용 된, 그들은 정렬 및 마이크로 어레이 프로파일에 사용 된 같은 영상도 분석한다.
Introduction
예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의)는 세포 기능 분화 및 동작의 분자 기초를 조사하기위한 강력한 모델 생물이다. 게놈, 신진 대사와 생합성 경로는 척추 동물과 유사하지만, 유전 및 분자 온순함 2 훨씬 크다. 장점 중의 크기와 간단한 해부학, 급속한 수명주기 (25 ° C에서의 3 일), 짧은 수명 (2 개월)과 자손의 많은 수 (> 200)이다. 그것의 자웅 동체 자연과 짧은 수명주기에, 분자 및 유전자 조작은 C로 간단합니다 형질 전환 동물 3,4와 같은 RNA 간섭과 같은 5 유전자 녹다운 기술의 애플리케이션의 생성 등의 elegans. C. 엘레 몸 껍질은 투명합니다. 따라서 세포는 쉽게 성인 및 표준 현미경을 사용하여 난자에 시각화 될 수있다. 지난 40 년 동안, C. 엘레 </EM> 커뮤니티 C.를위한 귀중한 자원을 만들었습니다 돌연변이, 녹아웃 및 형질 전환의 큰 컬렉션, 신경계 (8)의 전체 복원 등의 해부학과 개발 6,7에 대한 자세한 설명, 잘 주석과 공동체 전체에 사용할 수있는 완전히 시퀀스 게놈 (포함 엘레 조사 www.wormbase.com ).
많은 장점에도 불구하고, 몇 가지 실험 방법은 C에 도전 한 엘레. 이러한 조직 또는 세포 유형의 세포 및 아이솔레이션의 원형질막에 액세스를 필요로하는 것들을 포함한다. 실제로 C. 엘레 조직은 쉽게 효소 처리 또는 세제에 의해 소화되지 않는 그 압력 수압 골격 내에 국한된다. 1990 년대 말에 미리 암 굿맨과 자넷 리치먼드 C.의 전기 생리학 녹음하는 방법을 개척 엘레현장 9,10에있는 신경 세포와 근육 세포. 이러한 방법은 우리에게 신경 및 생체 내에서 근육의 기능에 중요한 통찰력을 준 반면, 도전과 낮은 처리량이다. 생체 내에서 세포의 기능을 연구하는 다른 방법은 대부분, 특히 같은 GCamP과 카멜레온 11-13로 유전자 인코딩 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징, 개발했다. 그들이 그대로 살아있는 동물에 적용되기 때문에 이러한 방법은 그러나, 약리학 적 도구의 사용을 허용하지 않는다.
배양 C.의 첫 번째 시도 대규모 체외에서 elegans의 세포는 자신의 박사 학위 논문 (14)의 준비 기간 동안 레어 꽃에 의해 만들어졌다. 불행히도, 어려움이 기판에 세포 접착 불량으로 발생한 불량 세포 분화 및 생존은 강력한 세포 배양 방법으로 초기 프로토콜의 설립을 방지. 1995 년 에드가와 동료 절차를 출판단일 C의 분리 및 배양 세포 분열 형태 형성을 알아보고자 하였다. 엘레 15 배아. 효소 처리 및 수동 해리의 조합으로 달걀 껍질의 소화하여 얻은 배아 세포는 ~ 500 세포를 15까지 생산, 증식을 계속했다. 그 후, 양조위와 동료 장 형태 형성을 연구하는 할구의 작은 숫자를 배양. 그들은 하나의 체외 격리 E의 할구가 혀끝있는 adherens 접속점 (16)를 통해 서로 상호 작용에 의해 장 루멘과 유사한 구조를 만든 편광 장 세포를 생산 것을 보여 주었다. Buechner와 동료는 또한 배양 C에 대한 유사한 방법을보고했다. 관내 17 배아 세포 엘레 간스.
초기 작업을 바탕으로, 크리와 동료 배아 C를 배양하기위한 강력한 프로토콜을 개발했다. 엘레 체외 1 세포. 그들그 고립 C를 보였다. 엘레 세포는 다양한 세포 유형으로 분화 및 세포 특정 마커의 발현을 포함하여 그들은 생체 내에서 소유 기능을 유지할 수있다. 생체 내에서 도전하고 몇 가지 기술, 절연 C.에 적용 할 수 있습니다 배아 세포 엘레 간스. 이러한 전기 생리학 1,18 19, 이미징 및 면역 화학적 방법 (20, 21)뿐만 아니라, 세포의 특정의 cDNA 라이브러리 (22, 23)의 건설 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 특정 세포 유형의 격리 (가) 있습니다. 이러한 RNA 간섭 (RNAi의)와 같은 유전자 녹다운 (knockdown) 기술은 배양 된 C.에 적용 할 수 있습니다 엘레 셀 1 및 당 단백질 발견을위한 도구로서 아지 설탕을 사용한 신규 한 대사 표지 방법은 최근 체외 배양 C. 개발되었다 엘레 세포 24.
결론적으로, 세포 배양 방법은 어레이 O를 앞서C.에 적용 할 수있는 F 기법 살아있는 유기체의 컨텍스트에서 유전자 기능을 해독하기위한 노력의 elegans 모델. 우리는 C.를 배양 여기 프로토콜을 설명 주로 첫 번째 크리스티안와 동료 1에 기술 된 프로토콜을 기반으로 체외에서 배아 세포 엘레 간스.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans의 개발, 행동과 노화에 관련된 유전자 경로를 해독하기위한 강력한 모델 생물이다. 그것의 편익은 주로이 유전자 조작 할 수있는 용이성에서와 짧은 수명주기에서 유래한다. 의 편의에도 불구하고, C. 엘레는 한계가있다. C.를 엘레 세포는 작은 그러한 마이크로 어레이 분석에 의해 유전자 발현 프로파일과 직접적인 같은 전기 생리학 및 약리학 기술 등 셀에 대한 액세…
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
Referências
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