En metode for dyrking Embryonic<em> C. elegans</em> Celler
Summary
Vi beskriver her en revidert protokoll for storskala kultur embryonale C. elegans celler. Embryonale C. elegans celler dyrket in vitro ved å bruke denne metoden, ser ut til å differensiere og rekapitulere ekspresjonen av gener i en celle spesifikk måte. Teknikker som krever direkte adgang til cellene og isolering av spesifikke celletyper fra andre vev kan påføres på C. elegans dyrkede celler.
Abstract
C. elegans er en kraftig modellsystem, i hvilket genetiske og molekylære teknikker er lett anvendelig. Inntil nylig har imidlertid teknikker som krever direkte tilgang til celler og isolering av spesifikke celletyper og kunne ikke bli anvendt i C. elegans. Denne begrensning skyldes det faktum at vev er innelukket i en trykksatt hårstråene som ikke er lett fordøyes ved behandling med enzymer og / eller vaskemidler. Basert på tidlig pioner arbeid av Laird Bloom, Christensen og kollegene pt utviklet en robust metode for dyrking C. elegans embryonale celler i stor skala. Egg er isolert fra av gravid voksne ved behandling med blekemiddel / NaOH og deretter behandlet med chitinase å fjerne eggeskall. Embryonale celler blir deretter dissosiert ved manuell pipettering og platet ut på substrat-dekket glass i serum-anrikede mediet. Innen 24 timer av isolasjonscellene begynner å differensiere ved å endre morfologi og ved å uttrykke celle spesifikke markers. C. elegans cellene dyrkes ved hjelp av denne metode overleve i opptil 2 uker, in vitro, og har vært benyttet for elektrofysiologisk, immunokjemisk, og avbildningsanalyser, så vel som de er blitt sortert, og som brukes for mikromatrise profilering.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en kraftig modellorganisme for å undersøke molekylære grunnlaget for cellulær funksjon, differensiering, og atferd. Mens sitt genom, metabolske og biosyntetiske banene er lik virveldyr ', dens genetiske og molekylære tractability er langt større to. Blant fordelene er dens størrelse og enkel anatomi, sin raske livssyklus (3 dager ved 25 ° C), kort levealder (2 uker) og stort antall avkom (> 200). På grunn av sin tvekjønnet natur og kort livssyklus, molekylære og genetiske manipulasjoner er grei i C. elegans, inkludert generering av transgene dyr 3,4 og anvendelsen av genet knock-down teknikker som RNA-interferens fem. C. elegans kropp og eggeskall er gjennomsiktig. Derfor celler kan lett visualiseres i både voksen og embryoet ved hjelp av standard mikroskopi. I de siste 40 årene, C. elegans </em> samfunnet har skapt uvurderlige ressurser for C. elegans forskning, inkludert en stor samling av mutanter, knockouts og transgenics, en detaljert beskrivelse av anatomi og utvikling 6,7, inkludert fullstendig rekonstruksjon av nervesystemet 8, og en helt sekvensert genomet som er godt merket og tilgjengelig for hele samfunnet ( www.wormbase.com ).
Til tross for de mange fordelene, har noen eksperimentelle tilnærminger vært utfordrende i C. elegans. Disse omfatter de som krever tilgang til plasmamembranen av celler og isolering av vev eller celletyper. Faktisk C. elegans vev er begrenset innenfor den hydrostatiske trykk skjelett, som ikke er lett fordøyes av enzymatisk behandling eller vaskemidler. På slutten av 1990-tallet Miriam Goodman og Janet Richmond pioner metoder for elektrofysiologiske opptak av C. elegansnevroner og muskelceller i situ 9,10. Selv om disse metodene ga oss viktig innsikt i nevronale og muskel funksjon in vivo, er de utfordrende og lav gjennomstrømming. Alternative metoder for å studere cellefunksjon in vivo hadde blitt utviklet, mest spesielt in vivo avbildning ved hjelp av kalsium-genetisk kodede kalsium sensorer slik som GCamP og Came 11-13. Disse metodene imidlertid ikke tillate bruk av farmakologiske verktøy, fordi de anvendes på intakte levende dyr.
Det første forsøket på dyrking C. elegans celler in vitro i stor skala ble gjort av Laird Bloom under utarbeidelsen av sin doktoravhandling 14. Uheldigvis vanskelighetene med dårlig adhesjon av cellene til substratet, dårlig celle differensiering og overlevelse hindret etableringen av denne tidlige-protokollen som en robust metode cellekultur. I 1995 Edgar og kolleger publiserte en prosedyreå undersøke celledeling og morphogenesis ved isolering og kulturen av en enkelt C-. elegans embryoer 15. Embryonale celler fremstilt ved fordøyelse av eggeskall med en kombinasjon av enzymatisk behandling og manuell dissosiasjon, fortsatte å spre seg, produsere opp til ~ 500 celler 15. Deretter Leung og medarbeidere dyrket et lite antall blastomeres å studere tarm morphogenesis. De viste at en in vitro isolert E blastomere produsert polarisert tarmceller som skapte en struktur analogt til intestinal lumen ved å samhandle med hverandre gjennom apikale adherens veikryss 16. Buechner og kolleger rapporterte også en lignende metode for dyrking C. elegans embryonale celler in vitro 17.
Basert på dette tidlige arbeid, Christensen og kolleger utviklet en robust protokoll for dyrking embryonale C. elegans celler in vitro en. Deviste at isolert C. elegans cellene kan differensieres til ulike celletyper og vedlikeholde de funksjonene som de besitter in vivo, inkludert uttrykk for celle-spesifikke markører. Flere teknikker som er utfordrende in vivo, kan påføres på isolert C. elegans embryonale celler. Disse omfatter elektro 1,18 19, avbildning, og immunkjemiske teknikker 20,21, samt isolering av spesifikke celletyper fra Fluorescent-aktivert cellesortering (FACS) for konstruksjon av cellespesifikke cDNA-biblioteker 22,23. Gene knockdown teknikker som RNA interferens (RNAi) kan brukes på kultivert C. elegans celler pt og en roman metabolsk merking metoden bruker Azido-sukker som et verktøy for glykoprotein oppdagelsen har nylig blitt utviklet for in vitro kultivert C. elegans celler 24.
Som konklusjon, ekspanderer cellekulturmetode matrisen of teknikker som kan brukes til C. elegans modell i et forsøk på å dechiffrere gen-funksjon i sammenheng med en levende organisme. Vi beskriver her protokollen for dyrking C. elegans embryonale celler in vitro, som i stor grad basert på protokollen først beskrevet av Christiansen og kolleger en.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans er en kraftig modellorganisme for å tyde den genetiske stier involvert i utvikling, atferd og aldring. Dens bekvemmelighet stammer primært fra den enkle som det kan være genetisk manipulert og fra sin korte livssyklus. Til tross for sin bekvemmelighet, C. elegans har sine begrensninger. C. elegans celler er små og innelukket i en trykksatt hårstråene som begrenser anvendelsen av metoder som krever direkte adgang til cellene, så som elektrofysiologiske og farmakologiske teknik…
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
Referências
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. . Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genética. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
