Um Método para o cultivo embrionário<em> C. elegans</em> Células

Summary

Descrevemos aqui um protocolo revisto para a cultura em grande escala de embrionário C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parece diferenciar e recapitular a expressão de genes de uma forma específica de célula. As técnicas que necessitem de acesso directo para as células ou o isolamento de tipos específicos de células a partir de outros tecidos podem ser aplicadas em C. elegans células cultivadas.

Abstract

C. elegans é um poderoso sistema de modelo, em que as técnicas genéticas e moleculares são facilmente aplicáveis. Até há pouco tempo, porém, as técnicas que requerem o acesso directo às células e o isolamento de tipos de células específicos, não pôde ser aplicada em C. elegans. Esta limitação foi devido ao facto de que os tecidos estão confinados dentro de uma cutícula pressurizado que não é facilmente digerida por tratamento com enzimas e / ou detergentes. Baseado no trabalho pioneiro por Laird Bloom, Christensen e seus colegas desenvolveram ^um método robusto para a cultura C. elegans células embrionárias em larga escala. Os ovos são isolados a partir de adultos grávidas por tratamento com lixívia / NaOH e subsequentemente tratado com quitinase para remover as cascas. As células embrionárias são, em seguida, dissociados por pipetagem manual e plaqueadas sobre substrato de vidro coberto, em meio enriquecido com soro. Dentro de 24 horas de celas de isolamento começam a diferenciar alterando a morfologia e expressando marke específico de célulars. C. elegans células cultivadas usando este método para sobreviver até duas semanas in vitro, e foram utilizados para electrofisiológico, imunoquímicos e de imagem, bem como as análises terem sido escolhidas e utilizadas para microsséries de perfilamento.

Introduction

Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um poderoso organismo modelo para investigar as bases moleculares da função celular, diferenciação e comportamento. Embora o seu genoma, metabólica e vias biossintéticas são semelhantes aos vertebrados ', a sua tratabilidade genética e molecular são muito maiores ^2. Entre as suas vantagens são o seu tamanho e a anatomia simples, o seu ciclo de vida rápida (3 dias a 25 ° C), tempo de vida curto (2 semanas) e um grande número de descendentes (> 200). Devido à sua natureza hermafrodita e ciclo de vida curto, manipulações moleculares e genéticos são simples em C. elegans, incluindo a geração de animais transgênicos ^3,4 ea aplicação de técnicas genéticas knock-down, como interferência de RNA ^5. C. elegans corpo e casca de ovo são transparentes. Portanto, as células podem ser facilmente visualizadas tanto no adulto e o embrião usando microscopia padrão. Nos últimos 40 anos, a C. elegans </em> comunidade criou recursos inestimáveis ​​para C. pesquisa elegans incluindo uma grande coleção de mutantes, nocautes e transgênicos, uma descrição detalhada da anatomia e desenvolvimento ^6,7, incluindo a reconstrução completa do sistema nervoso ^8, e um genoma completamente seqüenciado, que é bem anotado e disponível para toda a comunidade ( www.wormbase.com ).

Apesar das inúmeras vantagens, algumas abordagens experimentais têm sido um desafio em C. elegans. Estes incluem os que exigem a acessibilidade à membrana plasmática das células e isolamento de tecidos ou tipos celulares. Na verdade C. tecidos elegans estão confinados dentro do seu esqueleto hidrostática pressurizado, o qual não é facilmente digerida por tratamento enzimático ou detergentes. No final da década de 1990 Miriam Goodman e Janet Richmond pioneira métodos para registros eletrofisiológicos de C. elegansneurônios e células musculares em situ ^9,10. Embora estes métodos nos deu importantes insights sobre neuronal e na função muscular in vivo, eles são um desafio e baixo rendimento. Métodos alternativos para estudar a função das células in vivo foram desenvolvidos, principalmente nomeadamente imagiologia cálcio vivo utilizando sensores de cálcio geneticamente codificado como GCamP e cameleon ^11-13. Estes métodos, porém, não permite a utilização de ferramentas farmacológicas, porque eles são aplicados em animais vivos intactos.

A primeira tentativa de cultivo C. elegans células in vitro em larga escala foi feita por Laird Bloom durante a preparação da sua tese de doutoramento ^14. Infelizmente, as dificuldades encontradas com fraca adesão das células ao substrato, diferenciação celular pobres e sobrevivência impediu o estabelecimento deste protocolo no início como um método de cultura celular robusto. Em 1995, Edgar e colegas publicaram um procedimentopara investigar a divisão celular e morfogénese de isolamento e cultura de uma única C. elegans embriões ^15. As células embrionárias obtidos por digestão das cascas de ovo com uma combinação de tratamento enzimático e dissociação manual, continuou a proliferar, produzindo-se ~ 500 células para ^15. Posteriormente, Leung e colegas cultivaram um pequeno número de blastômeros para estudar a morfogênese intestinal. Eles mostraram que um em vitro isolado E blastômeros produziu células intestinais polarizadas que criaram uma estrutura análoga à do lúmen intestinal, interagindo uns com os outros através de aderentes apicais junções ^16. Buechner e seus colegas também relataram um método semelhante para cultura C. elegans células embrionárias in vitro ^17.

Com base neste trabalho precoce, Christensen e seus colegas desenvolveram um protocolo robusto para a cultura C embrionário. elegans células in vitro ^1. Elesmostrou que isolado C. elegans células podem diferenciar-se em vários tipos de células e manter as características que possuem in vivo, incluindo a expressão de marcadores específicos de células. Várias técnicas que são um desafio in vivo, pode ser aplicado em isolado C. elegans células embrionárias. Estes incluem electrofisiológico ^{1,18 19,} de imagem e de técnicas imunoquímicas ^20,21, bem como o isolamento de tipos de células específicas de célula fluorescente-Activated (FACS) para a construção de células específicas de bibliotecas de cDNA ^22,23. Gene knockdown técnicas, tais como interferência de RNA (RNAi) pode ser aplicado em cultura C. elegans células ¹ e um método de marcação metabólica novo usando azido-açúcar como uma ferramenta para a descoberta de glicoproteína, foi recentemente desenvolvido para cultivados in vitro C. elegans células ^24.

Em conclusão, o método de cultura de células se expande a matriz of técnicas que podem ser aplicadas para a C. modelo elegans num esforço para decifrar a função do gene no contexto de um organismo vivo. Descrevemos aqui o protocolo para o cultivo C. elegans células embrionárias in vitro, que é em grande parte baseado no protocolo descrito primeiramente por Christiansen e colegas ^1.

Protocol

Os asteriscos (*) indicam passos novos ou modificados, quando comparados com Christensen et al. 1 1. Configuração de materiais O procedimento de cultura celular requer grandes quantidades de ovos isolados de adultos grávidas. Crescer C. elegans em 8P placas de agar semeadas com NA22 (disponível através da C. elegans genética Consórcio – CGC) bactérias para isolar grandes quantidades de ovos. Nestas placas de a quantidade de peptona uti…

Representative Results

C. elegans células em cultura e diferenciar células expressam marcadores específicos Christensen e colegas usando a coloração azul de tripan demonstrou que> 99% dos embrionário C. elegans células sobrevivem ao procedimento de isolamento. No dia 9, e 22 após o plaqueamento, 85% e 65%, respectivamente, estão ainda vivos 1. Isolada embrionário C. células elegans devem aderir a um substrato, a fim de se diferenciar. As células que não c…

Discussion

C. elegans é um poderoso organismo modelo para decifrar os caminhos genéticos envolvidos no desenvolvimento, comportamento e envelhecimento. A sua conveniência provém principalmente da facilidade com que ele pode ser manipulado geneticamente e do seu ciclo de vida curto. Apesar da sua conveniência, C. elegans tem suas limitações. C. elegans células são pequenas e confinado dentro de uma cutícula pressurizado que limita a aplicação de métodos que requerem o acesso directo às célu…

Materials

			REAGENTS
Bacto Peptone	VWR International Inc.	90000-382
Difco Agar Granulated	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Bacto Yeast Extract	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
Sucrose	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glucose	Sigma	67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Cholesterol
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2	Sigma	C1016-500G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
MgSO4	Sigma	M2643-500 g
K2HPO4	Sigma	P2222-500G
KH2PO4	Sigma	P9791-500G
NaOH	Sigma	S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
			EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
50 ml Conical Tube	USA Scentific	1500-1811
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60×15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100×15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator