Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em> C. elegans</em> Hücreler
Summary
Biz embriyonik C. büyük ölçekli kültür için burada bir revize protokol açıklar hücreleri elegans. Embriyonik C. elegans Bu yöntemi kullanarak, in vitro olarak kültürlenmiş hücreler, bir hücre özel bir şekilde genlerin ekspresyonunu ayırt ve özetlemek için görünür. Doğrudan hücrelere erişimi ya da diğer dokulardan özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektiren C teknikleri uygulanabilir kültür hücreleri elegans.
Abstract
C. elegans genetik ve moleküler teknikler kolay uygulanabilir olduğu güçlü bir model sistem vardır. Yakın zamana kadar olsa da, hücreler ve özel hücre tiplerinin izolasyonu doğrudan erişim gerektiren teknikleri, C de uygulanamadı elegans. Bu sınırlama, dokuların kolayca enzimler ve / veya deterjan ile muamele ile sindirilmeyen bir basınçlı kütikül içinde sınırlı olmasından kaynaklanıyordu. Laird Bloom, Christensen ve 1 C kültürleme için sağlam bir yöntem geliştirdi meslektaşları tarafından erken öncü çalışmalara dayanarak Büyük ölçekli embriyonik hücreleri elegans. Yumurta ağartıcı / NaOH ile işlenerek gebe yetişkin izole edilmiş ve daha sonra da yumurta kabuğu kaldırmak için çitinaz ile tedavi edilir. Embriyonik hücreler daha sonra el ile pipetleme ayrılmış ve serum zenginleştirilmiş ortam içinde alt-tabaka kaplı cam üzerine kaplanmıştır. Izolasyon hücrelerin 24 saat içinde morfolojisi değiştirerek ve hücre spesifik marke ifade ederek ayırt başlarrs. C. elegans, bu yöntem kullanılarak kültür hücreleri, in vitro olarak 2 hafta kadar hayatta kalma ve elektrofizyolojik, immünokimyasal için kullanılmıştır ve bu kriteri ve mikroarray kullanılmaktadır gibi görüntüleme de analiz eder.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) hücresel fonksiyonun, farklılaşma ve davranış moleküler temellerini araştıran güçlü bir model organizmadır. Genom, metabolik ve biyosentetik yollar omurgalılar 'benzer olmakla birlikte, genetik ve moleküler tractability 2 çok daha fazladır. Avantajları arasında, onun büyüklüğü ve basit anatomi, onun hızlı yaşam döngüsü (25 ° C'de 3 gün), kısa ömürlü (2 hafta) ve yavrular çok sayıda (> 200) vardır. Nedeniyle hermaphroditic doğası ve kısa yaşam döngüsü, moleküler ve genetik manipülasyonlar C. basittir transgenik hayvanlarda 3,4 ve bu RNA girişim 5 gibi gen knock-down tekniklerin uygulanması da dahil olacak elegans. C. elegans vücut ve yumurta kabuğu şeffaf. Bu nedenle hücreleri kolayca yetişkin ve standart mikroskopi kullanılarak embriyo hem de görülebilir. Son 40 yıl içinde, C. elegans </em> topluluk C için çok değerli bir kaynak yarattı mutantlar, tırnakları ve transgeniklerinin geniş bir koleksiyon, sinir sistemi 8 tam yeniden yapılanma dahil anatomi ve geliştirme 6,7 ayrıntılı bir açıklama, ve de açıklamalı ve bütün topluma mevcuttur tamamen sıralı genom (dahil elegans araştırma www.wormbase.com ).
Sayısız avantajlara rağmen, bazı deneysel yaklaşımlar C. zorlu olmuştur elegans. Bu dokular ya da hücre tiplerinin hücre ve tecrit plazma zarına erişim gerektiren olanları içerir. Gerçekten C. elegans dokular kolayca enzimatik muamele ya da deterjanların tarafından sindirilir değil onun basınçlı hidrostatik iskelet, içinde hapsedilir. 1990'ların sonunda Miriam Goodman ve Janet Richmond C elektrofizyolojik kayıtlar için yöntemler öncülük elegansin situ 9,10 nöronlar ve kas hücreleri. Bu yöntemler bize nöronal ve in vivo kas fonksiyonu önemli bilgiler verirken, onlar zor ve düşük verim vardır. In vivo olarak, hücre fonksiyonlarını incelemek için alternatif yöntemler çoğunlukla, özellikle bu tür GCamP ve cameleon 11-13 genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörler kullanılarak kalsiyum vivo görüntüleme, geliştirilmiştir. Onlar bozulmadan yaşayan hayvanlar üzerinde uygulanır çünkü bu olsa yöntemleri, farmakolojik araçların kullanımına izin vermez.
Kültür C'de ilk girişimi Büyük ölçekli in vitro hücre elegans doktora tezi 14 hazırlanmasında Laird Bloom tarafından yapıldı. Ne yazık ki, zorluklar substrata hücrelerin zayıf yapışması ile karşılaşılan, zayıf hücre farklılaşması ve hayatta kalma güçlü bir hücre kültür yöntemi olarak bu erken protokol kurulmasını engelledi. 1995 yılında Edgar ve arkadaşları bir prosedür yayınladıTek bir C izolasyonu ve kültürü ile hücre bölünmesini ve morfogenetiğine araştırmak. elegans 15 embriyolar. Tedavisi ve enzimatik ayrışma manuel bir kombinasyonu ile yumurta kabuğu sindirilmesi ile elde edilen embriyonik hücreler, ~ 500 hücre 15 kadar üreten, çoğalmaya devam etti. Daha sonra, Leung ve arkadaşları bağırsak morfogenetiğine çalışma blastomerlerin küçük bir sayıda kültüre. Bunlar, bir in vitro izole edilmiş E blastomere apikal adherens birleşme 16 üzerinden birbirleri ile etkileşerek intestinal lümene benzer bir yapı oluşturulur polarize bağırsak hücreleri tarafından üretilebilir olduğunu gösterdi. Buechner ve arkadaşları, kültürleme C için benzer bir yöntem rapor etmiştir. 17, in vitro olarak embriyonik hücreleri elegans.
Bu erken çalışmalara dayanarak, Christensen ve arkadaşları embriyonik C kültürleme için sağlam bir protokol geliştirmiştir. elegans vitro 1 hücreler. Onlarbu izole edilmiş C göstermiştir. elegans hücreler, çeşitli hücre tipleri farklılaşmak ve hücreye özel markörlerin ekspresyonu dahil olmak üzere, in vivo olarak sahip olduğu özellikleri muhafaza edebilir. In vivo olarak zor olan çeşitli teknikler, izole edilmiş C uygulanabilir embriyonik hücreleri elegans. Bu elektrofizyolojik 1,18 19, görüntü işleme ve immünokimyasal teknikleri 20,21, hem de hücreye özgü cDNA kütüphanelerinin 22,23 inşası için (FACS) floresan aktive hücre spesifik hücre tipleri izolasyonunu içerir. Bu tür RNA girişim (RNAi) olarak Gene demonte teknikleri kültürlenmiş C uygulanabilir elegans hücreler 1 ve glikoprotein keşfi için bir araç olarak Azido-şeker kullanarak yeni bir metabolik etiketleme yöntemi, son zamanlarda in vitro kültürlenmiştir C için geliştirilmiştir elegans hücreleri, 24.
Sonuç olarak, hücre kültürü yöntemi dizi o genişletirC. uygulanabilir f teknikleri Bir canlı organizmanın bağlamında gen fonksiyonunu çözmek için bir çaba elegans modeli. Biz C kültürleme için buraya protokolü açıklamak büyük ölçüde birinci Christiansen ve arkadaşları 1 tarafından tarif edilen protokole göre in vitro olduğu, embriyonik hücreler elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans gelişim, davranış ve yaşlanma ile ilgili genetik yollar deşifre için güçlü bir model organizmadır. Onun rahatlığı öncelikle genetik manipüle edilebilme kolaylığından ve kısa yaşam döngüsü kaynaklanıyor. Onun kolaylık rağmen, C. elegans sınırlamaları vardır. C elegans hücreler son derece küçük ve bu mikro-dizi analizi ile gen ekspresyon profili olarak, doğrudan bu tür elektrofizyolojik ve farmakolojik teknikleri gibi hücrelere erişim, veya özel …
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
Referências
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. . Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genética. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
