En fremgangsmåde til dyrkning Embryonale<em> C. elegans</em> Celler
Summary
Vi beskriver her en revideret protokol for storstilet kultur embryonale C. elegans celler. Embryonale C. elegans celler dyrket in vitro ved hjælp af denne metode synes at differentiere og rekapitulere ekspression af gener i en celle-specifik måde. Teknikker, der kræver direkte adgang til cellerne eller isolering af specifikke celletyper fra andre væv, kan anvendes på C. elegans dyrkede celler.
Abstract
C. elegans er en kraftfuld model system, hvor genetiske og molekylære teknikker er let anvendelig. Indtil for nylig selv, teknikker, der kræver direkte adgang til celler og isolering af bestemte celletyper, ikke kunne anvendes i C. elegans. Denne begrænsning skyldes det faktum, at væv er begrænset inden for en tryksat kutikula, som ikke er let fordøjeligt ved behandling med enzymer og / eller detergenter. Baseret på tidlig pioner arbejde af Laird Bloom, Christensen og kolleger 1 udviklet en robust metode til dyrkning af C. elegans embryonale celler i stor skala. Æggene isoleres fra gravide voksne ved behandling med blegemiddel / NaOH og efterfølgende behandlet med chitinase at fjerne æggeskaller. Embryonale celler dissocieres derefter ved manuel pipettering og udpladet på substrat-dækket glas i serum-berigede medier. Indenfor 24 timer isolation celler begynder at differentiere ved at ændre morfologi og ved at udtrykke celle specifikke markers. C. elegans celler dyrket under anvendelse af denne metode overleve op 2 uger in vitro og er blevet anvendt til elektrofysiologisk, immunkemiske og billedbehandling analyser såvel som de er blevet sorteret og anvendes til microarray profilering.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en kraftig model organisme til at undersøge de molekylære grundlag for cellulær funktion, differentiering og adfærd. Mens dens genom, metaboliske og biosynteseveje ligner hvirveldyr ', dets genetiske og molekylær medgørlighed er langt større 2. Blandt dens fordele er dens størrelse og enkel anatomi, dets hurtige livscyklus (3 dage ved 25 ° C), kort levetid (2 dage) og store antal afkom (> 200). På grund af sin hermafroditiske natur og kort levetid, molekylære og genetiske manipulationer er ligetil i C. elegans, herunder produktion af transgene dyr 3,4 og anvendelse af gen-knock-down teknikker såsom RNA-interferens 5.. C. elegans krop og æggeskal er gennemsigtige. Derfor celler kan let visualiseres i både voksen og foster ved hjælp af standard-mikroskopi. I de sidste 40 år, C. elegans </em> samfund har skabt uvurderlige ressourcer for C. elegans forskning, herunder en stor samling af mutanter, knockouts og transgene, en detaljeret beskrivelse af anatomi og udvikling 6,7, herunder den fulde genopbygning af nervesystemet 8, og et helt genom, som er godt kommenteret og til rådighed for hele samfundet ( www.wormbase.com ).
På trods af de mange fordele, har nogle eksperimentelle metoder været udfordrende i C. elegans. Disse omfatter dem, der kræver adgang til plasmamembranen af cellerne og isolering af væv eller celletyper. Faktisk C. elegans væv findes inden for dets tryk hydrostatisk skelet, som ikke er let fordøjeligt ved enzymatisk behandling eller rengøringsmidler. I slutningen af 1990'erne Miriam Goodman og Janet Richmond banebrydende metoder til elektrofysiologiske optagelser af C. elegansneuroner og muskelceller situ 9,10. Mens disse metoder gav os et vigtigt indblik i neuronal og muskel funktion in vivo, er de udfordrende og lave gennemløb. Var blevet udviklet alternative metoder til at studere celle funktion in vivo, for det meste især in vivo calcium imaging med genetisk indkodede calcium sensorer såsom GCamP og Cameleon 11-13. Disse metoder dog ikke tillade brug af farmakologiske værktøjer, fordi de anvendes på intakte levende dyr.
Det første forsøg på dyrkning C. elegans celler in vitro i stor skala blev lavet af Laird Bloom under udarbejdelsen af sin ph.d.-afhandling 14. Desværre stødt på vanskeligheder med dårlig vedhæftning af cellerne til underlaget, dårlig celledifferentiering og overlevelse forhindrede etableringen af denne tidlige protokol som en robust cellekultur metode. I 1995 offentliggjorde Edgar og kolleger en procedureat undersøge celledeling og morfogenese ved isolering og dyrkning af en enkelt C. elegans embryoner 15. Embryonale celler opnået ved spaltning af æggeskaller med en kombination af enzymatisk behandling og manuel dissociation fortsat proliferere producere op til ~ 500 celler 15. Efterfølgende Leung og medarbejdere dyrkes et lille antal blastomeres at studere tarm-morfogenese. De viste, at en in vitro isolerede E blastomer produceret polariserede tarmceller, der skabte en struktur analog med tarmlumen ved at interagere med hinanden via apikale adherens junctions 16. Buechner og kolleger også rapporteret om en lignende metode til dyrkning C. elegans embryonale celler in vitro 17.
Baseret på dette tidlige arbejde, Christensen og kolleger udviklet en robust protokol til dyrkning embryonale C. elegans celler in vitro 1. Deviste, at isolerede C. elegans celler kan differentiere til forskellige celletyper og vedligeholde de funktioner, som de besidder i vivo, herunder afgivelse af celle-specifikke markører. Adskillige teknikker, der udfordrer in vivo, kan anvendes på isolerede C. elegans embryonale celler. Heriblandt elektrofysiologisk 1,18 19, billedbehandling og immunokemiske teknikker 20,21, samt isolering af specifikke celletyper fluorescerende cellesortering (FACS) til opførelse af cellespecifikke cDNA-biblioteker 22,23. Gene Knockdown teknikker såsom RNA-interferens (RNAi) kan anvendes på dyrkede C. elegans celler 1 og en hidtil ukendt metabolisk mærkning under anvendelse azido-sukker som et redskab til glycoprotein opdagelse er for nylig blevet udviklet til in vitro dyrket C. elegans celler 24.
Afslutningsvis cellekultur metode udvider array of teknikker, der kan anvendes på C. elegans model i et forsøg på at dechifrere genfunktion i forbindelse med en levende organisme. Vi beskriver her protokollen for dyrkning af C. elegans embryonale celler in vitro, hvilket stort set er baseret på protokol først beskrevet af Christiansen og kolleger 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans er en kraftfuld model organisme til at dechifrere de genetiske pathways involveret i udvikling, adfærd og aldring. Dens bekvemmelighed stammer primært fra den lethed, hvormed det kan være genetisk manipuleret, og fra sin korte levetid. På trods af sin bekvemmelighed, C. elegans har sine begrænsninger. C. elegans celler er lille og begrænset inden for en tryksat kutikula, som begrænser anvendelsen af metoder, som kræver direkte adgang til cellerne, såsom elektrofysiologiske …
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
Referências
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. . Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genética. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
