Resezione del nervo tibiale - Un modello standardizzato per Denervation indotta scheletrico atrofia muscolare nei topi
Summary
Il modello di resezione del nervo tibiale è un modello ben tollerato, validato e riproducibile di atrofia del muscolo scheletrico. Il protocollo chirurgico modello è descritto e dimostrato in C57Black6 topi.
Abstract
Il modello di resezione del nervo tibiale è un modello ben tollerato, validato e riproducibile di denervazione indotta atrofia del muscolo scheletrico nei roditori. Benché originariamente sviluppato e ampiamente utilizzato nel ratto causa delle sue grandi dimensioni, il nervo tibiale nei topi è abbastanza grande da poter essere facilmente manipolato con uno schiacciamento o transezione, lasciando i rami peroneale e surale del nervo sciatico intatto e preservando così i loro muscoli bersaglio. Così, questo modello offre i vantaggi di indurre minore morbilità e impedimento della deambulazione rispetto al modello resezione del nervo sciatico e permette anche ai ricercatori di studiare i fisiologici, cellulare e molecolare dei meccanismi biologici che regolano il processo di atrofia muscolare nei topi geneticamente modificati. Il nervo tibiale fornisce il gastrocnemio, soleo e muscoli plantare, quindi la sua recisione permette lo studio del muscolo scheletrico denervato composto da fibre a contrazione rapida di tipo II e / o tipo di contrazione lenta iofibre. Qui mostriamo il modello recisione del nervo tibiale nel topo C57Black6. Valutiamo l'atrofia del muscolo gastrocnemio, come un muscolo rappresentante, a 1, 2 e 4 settimane dopo la denervazione misurando pesi muscolari e l'area specifica il tipo di fibra trasversale su paraffina sezioni istologiche immunocolorate per una rapida contrazione della miosina.
Introduction
Denervazione del muscolo scheletrico, a causa di una lesione traumatica dei nervi periferici, malattie o intervento farmacologico, comporta l'immediata perdita della funzione contrattile del muscolo volontario. Muscle inizia in concomitanza ad atrofizzarsi e questa atrofia è reversibile se tempestivo, reinnervazione di buona qualità si verifica 1,2. In assenza di reinnervazione, myofiber atrofia progredisce, e cambiamenti biologici irreversibili nel muscolo si verifica con fibrosi muscolare e morte miofibre. Qui mostriamo il modello nervo tibiale resezione, un modello di denervazione indotta-atrofia del muscolo scheletrico e la fibrosi, nei topi. Questo modello consente agli scienziati di studiare le fisiologiche, cellulari e molecolari meccanismi biologici che sono alla base atrofia muscolare in vivo nei muscoli gastrocnemio e soleo. Mentre storicamente utilizzato prevalentemente nei ratti, di più recente applicazione di questo modello ad eliminazione diretta e le linee di topi transgenici in particolare, consente agli investigatori di valutare il ruolo dei loroparticolare proteina (s) di interesse nella induzione, sviluppo e manutenzione, o in alternativa la risoluzione, atrofia muscolare e fibrosi in vivo.
Il nervo tibiale è un nervo periferico motore-sensoriale mista nel hindlimb roditore, ed è uno dei tre rami terminali del nervo sciatico. Recisione del nervo tibiale denervates gastrocnemio, soleo e muscoli plantare (e le tre piccoli muscoli flessori profondi del piede compreso tibiale posteriore, flessore lungo delle dita e flessore hallicus longus), ed è un modello ben standardizzati e validati nei ratti 3,4 . I muscoli gastrocnemio e soleo può essere facilmente sezionato in momenti seriali postare recisione del nervo tibiale, fissati e trattati per la valutazione di istologia dei muscoli e fibre muscolari morfometria, o Flash congelati per l'estrazione di RNA e proteine muscolari a scopo di studio, per esempio, le reti cellulari di segnalazione che regolano l'atrofia muscolare. La gastrocnemius muscolare è un tipo di fibra muscolare misto (tipo I e tipo II, anche se prevalentemente di tipo II) e il muscolo soleo è composto da una grande percentuale di fibre di tipo I, fornendo in tal modo sia veloce e lenta contrazione muscolare per la valutazione 5,6. Il modello di resezione del nervo tibiale è adatto per studiare il processo di denervazione indotta da atrofia muscolare, sia a breve termine (giorni) 7 e lungo termine (settimane o mesi) 4,8.
In contrasto con il modello transezione del nervo sciatico (un secondo modello di denervazione indotta atrofia muscolare comunemente usato nei roditori), transezione del nervo tibiale induce meno morbilità nell'animale, rendendolo un modello più attraente. Transezione del nervo sciatico denervates tutti i muscoli della gamba (sotto il ginocchio) e piede, riducendo la capacità del animale di deambulare 2, mentre transezione del nervo tibiale lascia i rami del nervo peroneo e surale del nervo sciatico intatto, preservando cosìi loro muscoli bersaglio e territori sensoriali. Il mouse è in grado di flessione plantare oppure invertire il piede, ma è in grado di deambulare facilmente e sopporta il peso equamente sui due arti posteriori, diminuendo così significativamente la morbidità del modello. Andatura studi di analisi che valutano i modelli a piedi sono stati condotti in ratti dopo lesioni del nervo tibiale e sciatico e dimostrare che ingombro e peso del cuscinetto è meglio conservato con lesione tibiale 9,10. Inoltre, nel modello transezione del nervo tibiale, il nervo peroneo può essere mobilizzato in un punto temporale successivo e trasferita come fonte di ritardata reinnervazione, se il disegno studio richiede 3. Al contrario, ritardato reinnervazione nel modello transezione del nervo sciatico richiede l'uso di un innesto nervoso al deficit nervo sciatico, molto aumentando notevolmente la difficoltà tecnica del modello e limitazione all'uso chirurghi qualificati.
Mentre il nervo tibiale modello transection requires familiarità dell'operatore con tecnica operatoria sterile nella chirurgia degli animali, sia il nervo tibiale e muscoli del polpaccio si innerva sono facilmente accessibili e identificabili per la manipolazione, in modo che gli individui che non sono chirurghi, o di grande esperienza con la chirurgia degli animali, possono facilmente padroneggiare questo modello .
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nervo modello di resezione tibiale di atrofia del muscolo scheletrico denervazione-indotta è un modello comunemente impiegato e ben convalidato nei ratti. Abbiamo adattato questo modello per l'uso in topi, che consente al ricercatore di sfruttare la presenza di topi geneticamente ingegnerizzati e studiare il processo di atrofia muscolare in vivo, in assenza di proteine fondamentali per la regolazione della massa muscolare 7,8. I muscoli gastrocnemio e soleo, sia denervato in questo mode…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal partenariato Cihr neuromuscolare della ricerca (JNM – 90.959; al Jaeb).
Materials
| Reagents and Materials | |||
| 10-0 Nylon suture | Ethicon | 2850G | |
| 5-0 Vicryl suture | Ethicon | J553G | |
| Equipment | |||
| Spring microdissecting scissors | Fine Surgical Tools | 15021-15 | |
| Ultra fine forceps | Fine Surgical Tools | 11370-40 | |
| Non locking micro needle holder (driver) | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Spring retractor | Fine Surgical Tools | 17000-02 |
Referências
- Fu, S. Y., Gordon, T. Contributing factors to poor functional recovery after delayed nerve repair: prolonged denervation. J. Neurosci. 15, 3886-3895 (1995).
- Kobayashi, J., Mackinnon, S. E., Watanabe, O., Ball, D. J., Gu, X. M., Hunter, D. A., Kuzon, W. M. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20, 858-866 (1997).
- Bain, J. R., Veltri, K. L., Chamberlain, D., Fahnestock, M. Improved functional recovery of denervated skeletal muscle after temporary sensory nerve innervation. Neurociência. , 103-503 (2001).
- Batt, J., Bain, J., Goncalves, J., Michalski, B., Plant, P., Fahnestock, M., Woodgett, J. Differential gene expression profiling of short and long term denervated muscle. FASEB J. 20, 115-117 (2006).
- Sher, J., Cardasis, C. Skeletal muscle fiber types in the adult mouse. Acta Neurol. Scand. 54, 45-56 (1976).
- Agbulut, O., Noirez, P., Beaumont, F., Butler-Browne, G. Myosin heavy chain isoforms in postnatal muscle development of mice. Biol. Cell. 95, 399-406 (2003).
- Nagpal, P., Plant, P. J., Correa, J., Bain, A., Takeda, M., Kawabe, H., Rotin, D., Bain, J. R., Batt, J. A. The ubiquitin ligase nedd4-1 participates in denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. PLoS ONE. 7, e46427 (2012).
- Plant, P. J., Bain, J. R., Correa, J. E., Woo, M., Batt, J. Absence of caspase-3 protects against denervation-induced skeletal muscle atrophy. J. Appl. Physiol. 107, 224-234 (2009).
- Varejao, A. S., Meek, M. F., Ferreira, A. J., Patricio, J. A., Cabrita, A. M. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis. J. Neurosci. Methods. 108, 1-9 (2001).
- Willand, M. P., Holmes, M., Bain, J., Fahnestock, M., de Bruin, H. Electrical muscle stimulation after immediate nerve repair reduces muscle atrophy without affecting reinnervation. Muscle Nerve. 48, 219-225 (2013).
- Sterne, G. D., Coulton, G. R., Brown, R. A., Green, C. J., Terenghi, G. Neurotrophin-3-enhanced nerve regeneration selectively improves recovery of muscle fibers expressing myosin heavy chains 2b. J. Cell Biol. 139, 709-715 (1997).
- Plant, P. J., North, M. L., Ward, A., Ward, M., Khanna, N., Correa, J., Scott, J. A., Batt, J. Hypertrophic airway smooth muscle mass correlates with increased airway responsiveness in a murine model of asthma. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 46, 532-540 (2012).
- Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast. Reconstr. Surg. 83, 129-138 (1989).
- Hare, G. M., Evans, P. J., Mackinnon, S. E., Best, T. J., Midha, R., Szalai, J. P., Hunter, D. A. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Ann. Plast. Surg. 30, 147-153 (1993).
- McLean, J., Batt, J., Doering, L. C., Rotin, D., Bain, J. R. Enhanced rate of nerve regeneration and directional errors after sciatic nerve injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma knock-out mice. J. Neurosci. 22, 5481-5491 (2002).
- Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. J. Vis. Exp. (54), e3092 (2011).
- Rogoz, K., Lagerstrom, M. C., Dufour, S., Kullander, K. VGLUT2-dependent glutamatergic transmission in primary afferents is required for intact nociception in both acute and persistent pain modalities. Pain. 153, 1525-1536 (2012).
- Thornell, L. E. Sarcopenic obesity: satellite cells in the aging muscle. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 14, 22-27 (2011).
