Антитела Окрашивание в<em> С. Элеганс</em> Использование "Freeze-Крекинг"
Summary
"Freeze-трещин," метод подвергая внутренние ткани нематод C. Элеганс к антител для локализации белка, демонстрируется.
Abstract
Чтобы окрасить C. Элеганс с антителами, относительно непроницаемой кутикулы должны быть обойдены с помощью химических или механических методов. "Заморозить взлома" является одним из методов, используемое для физического тянуть кутикулу от нематод путем сжатия нематоды между двумя прикрепленных горками, замораживая их, и потянув слайды друг от друга. Freeze-крекинга обеспечивает простой и быстрый способ получить доступ к тканям без химической обработки и могут быть использованы с различными фиксаторов. Однако, это приводит к потере многих образцов и требуемое сжатие механически искажает образец. Практика требуется, чтобы максимизировать восстановление образцов с хорошей морфологией. Freeze-крекинг могут быть оптимизированы для конкретных условий фиксации, сбора проб или низкой неспецифической окрашивания, но не по всем параметрам сразу. Для антител, которые требуют очень жестких условий фиксации и терпеть химических обработок, необходимых для химически проницаемыми кутикулу, ЛЕЧЕНИИможет быть предпочтительным т интактных нематод в растворе. Если антитело требует более легкий исправление или, если оптимальные условия фиксации неизвестны, сублимационной крекинг обеспечивает очень полезный способ быстро анализе антитело и может дать определенную внутриклеточную и клеточный информации для локализации представляющим интерес антигеном.
Introduction
Для определения клеточного и внутриклеточную локализацию белков, ученые традиционно помечены ткани с антителами, выбранными специфически распознавать специфические белки 1. В некоторых модельных организмов, таких как C. Элеганс, окрашивание антител часто заменяется молекулярно-генетических методов, которые быстрее дают результаты. Они включают трансформирующие организмов с конструкциями, состоящими из гена слияния между промотором и кодирования областей интересующего гена и зеленый флуоресцентный белок. Тем не менее, молекулярные методы с учетом ряда артефактов, в том числе проблем с зная истинного промотор и изменения в экспрессии конструктов на большого числа копий (обычные методы в C. Элеганс) 2,3. Поэтому окрашивание с антителами остается целью для многих ученых, изучающих функцию белка в естественных условиях.
Окрашивание ткани с антителами может быть трудно, посколькуtibodies может признать только их антиген в определенной конформации 1. Например, антитела могут распознавать только денатурированный или интактный антиген фиксированный в определенном направлении и не может распознавать антиген на месте. Проблема окрашивания антител у нематод усугубляется тем, что кутикула нематод образует относительно непроницаемый барьер, блокируя доступ антител к тканям.
Есть несколько различных методов, используемых для окрашивания антител в С. Элеганс (отзывы в нашей предыдущей работе 4). Чтобы окрасить нетронутыми "червей," методы были разработаны, чтобы заморозить и разморозить в относительно жестком фиксатором (формальдегида или глутаральдегида); циклы замораживания-оттаивания помочь взломать кутикулу, чтобы позволить быстрое проникновение закрепляющего 5. После фиксации кутикула был проницаемыми, чтобы позволить проникновение антитела; методы включали лечение с восстанавливающими агентами, коллагеназы, или обоих 5-7. Эти тreatments сохранились морфологию, но часто сводится или уничтожены признание антител. Альтернативные методы включают рассечение 8, чтобы позволить проникновение антител.
"Заморозить взлома" является одним из способов получить доступ к внутренней части полу-нетронутыми червя, чтобы антитела окрашивания 9-10. Freeze-крекинг может быть выполнена с различными условий фиксации, избегая при этом коллагеназы и сокращению процедуры. Нематоды помещают между двумя клеев слайдов, замораживают, а затем скользит разделены, в результате чего большую часть нематод на нижней стекло и большую часть кутикулы на верхнем слайде. В нижней слайд могут быть помещены в фиксаторе и весь слайд с прилипших нематод передается с помощью процедуры окрашивания антителом. Метод действительно представляет две основные трудности. Во-первых, это трудно применить правильное количество давления, необходимого, чтобы разделить нематод без серьезного деформируя их. Во-вторых, многие из червей не будет сотметка о любом слайде, и будут потеряны в фиксатора или полосканий. Тем не менее, с соответствующими слайдами и практике метод быстро дает нематод с достаточной морфологии который может быть использован с широким спектром фиксаторов и антител.
Способ может быть изменена незначительно, в зависимости от цели экспериментатора. Если окрашивание отдельных нематод нужен (например, чтобы определить, был ли изменен один трансформант окрашивание антител), а затем скользит с максимальной адгезии (но выше фона окрашивание) может быть использована, например, в лабораторных подготовлен слайдов с дополнительной полилизина (см. ниже). Для формальдегида или глутаральдегида фиксации, более высокие горки адгезии (лабораторные подготовлены Полилизиновые слайды) следует использовать, так как нематоды придерживаться более плохо с полилизином после этих записей. Если нематоды дикого типа в настоящее время фиксировали метанолом и / или ацетоном, затем слайды с низкой адгезией и ниже окрашивание фона следует использовать (коммерческая или лaboratory подготовлены слайды). Если разнообразие антител и фиксаторов используются в лаборатории, выбор слайдов могут быть получены заранее и хранить до необходимости.
После доступ к нематоде ткани был накоплен, процедуры окрашивания антител следовать стандартные методы (с более длинными инкубации, характерных для тканей, а не клеток 1,11).
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол замораживания взлома является одним из нескольких методов окрашивания антител в С. Элеганс. Это обеспечивает относительно простой способ окрасить червей, но требует специфических реагентов и практики для достижения оптимальных результатов. Критические шаги (изложенны?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование было предоставлено NSF CCLI # 0633618 и университета Огайо. Некоторые штаммы были предоставлены Caenorhabditis генетический центр. Аспирант Reetobrata Басу появляется в видео.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
Referências
- Harlow, E., Lane, D. . Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).
- Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
- Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook. , (2006).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans. Development. 117, 1071-1087 (1993).
- Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).
- Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line. Development. 120, 2901-2911 (1994).
- Strome, S., Wood, W. B. Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).
- Albertson, D. G. Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos. Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).
- Harlow, E. . Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. WormBook. , (2006).
