En Microplade Assay til vurdering af kemiske Virkninger på RBL-2H3 mastcelledegranulering: Effekter af Triclosan uden brug af et organisk opløsningsmiddel

Summary

Mastcelledegranulering, frigivelse af allergiske mediatorer, er vigtig i allergi, astma og parasit forsvar. Her viser vi teknikker ^1. til vurdering effekter af narkotika og giftstoffer på degranulering, metodologi for nylig udnyttet til at udstille den magtfulde hæmmende effekt af antibakterielt middel triclosan ^2..

Abstract

Mastceller spiller vigtige roller i allergisk sygdom og immun forsvar mod parasitter. Når aktiveret (fx ved et allergen), de degranulate, en proces, der resulterer i exocytose af allergiske mediatorer. Modulation af mastcelledegranulering af narkotika og giftstoffer kan have positive eller negative virkninger på menneskers sundhed. Mastcelle funktionen er dissekeret i detaljer med anvendelsen af rotte basofile leukæmi mastceller (RBL-2H3), en bredt accepteret model for humane slimhinde mastceller ^3-5. Mastcelle granula komponent og den allergiske mediator β-hexosaminidase, som frigives lineært i tandem med histamin fra mastceller ^6, nemt og pålideligt kan måles ved reaktion med et fluorogent substrat, gav målelig fluorescensintensitet i en mikroplade assay, der er modtagelig for high-throughput undersøgelser ^1.. Oprindeligt udgivet af NAAL et al. ^1., har vi tilpasset denne degranulering assay for screening of narkotika og giftstoffer, og demonstrerer dens anvendelse her.

Triclosan er et bredspektret antibakterielt middel, der er til stede i mange forbrugerprodukter og har vist sig at være en terapeutisk støtte i human allergisk hudsygdom ^7-11, selvom mekanismen for denne virkning er ukendt. Her viser vi et assay for effekten af ​​triclosan på mastcelledegranulering. Vi har for nylig vist, at triclosan kraftigt påvirker mastcelle funktion ^2. I et forsøg på at undgå brugen af et organisk opløsningsmiddel, er triclosan opløses direkte i vandig puffer med varme og omrøring, og resulterende koncentration bekræftes ved hjælp af UV-Vis spektrofotometri (hjælp ε ₂₈₀ = 4,200 L / M / cm) ^12. Denne protokol har potentialet til at blive brugt med en række kemikalier til at bestemme deres virkninger på mastcelledegranulering, og mere generelt, deres allergiske potentiale.

Introduction

Mastceller er stærkt granulerede immuneffektorceller der tjener som centrale mediatorer ved astma, allergi, parasitter forsvar og cancerogenitetsundersøgelser ^13-16. De bor i næsten alle vaskulariseret væv ^15, hvor de sikkert gemme allergiske og inflammatoriske mediatorer i cytoplasmatiske granula indtil aktiveres for at degranulate. Degranulering er exocytose af membranbundne granulat, hvilket resulterer i frigivelsen af farmakologisk aktive mediatorer, såsom histamin, tryptase, og leukotriener ^15.. Denne proces resulterer i indledningen af type I overfølsomhedsreaktioner, der er kritiske i montering forsvar mod parasitter samt indlede allergiske, astmatiske og kræftfremkaldende reaktioner ^15..

Mastceller og basofile udtrykker FcsRl receptorer, de høj affinitet receptorer for immunglobulin E (IgE) ^17. Udsættelse for et allergen eller antigen forårsager aggregering af multiple IgE-bundet FcERI receptorer ^17, og det er dette so-kaldet "tværbinding" af IgE-bundne Fc-receptorer som igangsætter degranulation processen: en kaskade af tyrosinphosphorylering begivenheder, aktivering af phospholipase C, udstrømningen af calcium fra interne butikker, og calcium-influx i cellen ^18. Denne calciumindløb er nødvendig for degranulering, og endvidere signalerer granulat fusion med membranen, før forårsager granulat exocytose ^15. Eksperimentelt kan et calciumionophor anvendes til shuttle calcium direkte over cellemembranen ^19, som i det væsentlige omgår alle signaltransduktion skridt før calciumindløb trin ^20, der giver mulighed for identifikation af en sti målet ved en giftstof som værende opstrøms eller nedstrøms calcium signalering ^20..

Degranulering kan måles hurtigt og effektivt ved at overvåge frigivelse af β-hexosaminidasens i celle supernatant, som frigives lineært fra granulatet sammen histamin ^6, men jegs meget lettere at detektere ved hjælp af en simpel enzym-substrat reaktion og en mikropladelæser til assay fluorescerende produkt. Denne mikroplade assay som beskrevet i protokollen afsnit er baseret på en robust metode oprindeligt blev udviklet af NAAL et al. ^1, som kvantificerer spaltning af det fluorogene substrat 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide ved β- hexosaminidase. Vi har ændret analysen til test effekter af lægemidler og giftstoffer, med triclosan fremhævet her. Denne metode pålideligt kvantificerer degranulering, er et billigt alternativ til, for eksempel flow-cytometrisk-baserede detekteringsmetoder ^21, og har potentiale til at egner sig pænt til high-throughput screening af en lang række anti-allergi medicin, samt immuntoksiske eller allergifremkaldende kemikalier. Dette sidste punkt er især vigtigt i lyset af 2007-National Research Council rapport "toksicitetstestning i det ^21. århundrede: en vision og en Strattegi "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), der går ind for udviklingen af højt gennemløb toksikologiske tests, der anvender cellekultur at reducere bekostelig brug af traditionelle forsøgsdyr såsom mus. Degranuleringen protokol udviklet af NAAL et al. ¹ og modificeret af os ^2, udnytter RBL-2H3-cellelinien, som er et godt accepteret model homolog til humane slimhinde mastceller eller basofiler ^3-5. (Fremgangsmåder til dyrkning RBL-2H3 celler er beskrevet i Hutchinson et al. ^22). Dette assay kan sandsynligvis tilpasses enhver vedlagte mast celletype.

Triclosan (TCS) er et bredspektret antimikrobielt der har været brugt i mere end 30 år på hospitaler, personlig pleje, og forbrugsgoder ^23,24. Virkningsmekanismen for FKS s antimikrobielle kendetegn er hæmning af fedtsyrer biosyntesen, sandsynligvis ved at hæmme enoyl-acylbærerprotein reduktase ^25,26. Det findes i hele verden i en bred vifte af forbrugerprodukter såsom shower gel, hånd lotion, tandpasta, mundskyl, og håndsæber i koncentrationer op til 0,3% eller 10 mM ^24.. Udbredt brug af FKS har resulteret i påviselige niveauer i mennesker ^27-29 samt i floder og vandløb ^30. En undersøgelse udført af Allmyr et al. ^27. påvist, at TCS og dets metabolitter er til stede i både plasma og mælk fra ammende mødre. Vigtigst er TCS let absorberes i huden ^31-37. Queckenberg et al. ^37. fundet ~ 10% absorption af en ~ 70 mM TCS fløde i menneskers hud inden 12 timer, hvilket resulterer i betydelig koncentration i huden, hvor mastceller bor.

FKS har vist klinisk at styre human allergisk hudsygdom ^7-11, men den mekanisme, hvormed TCS lindrer allergiske hudsygdomme har været ukendt ^38. Anvendelse af fluorescerende mikroplade assay detailed i denne video, vi for nylig påvist, at FKS, ved koncentrationer så lave som 2 uM, væsentligt dæmper mast celle funktion og degranulering, som udgør en potentiel forklaring på disse kliniske data ^2. Ud over at give en forklaring på disse kliniske data. Vores resultater i Palmer et al ² tyder på, at TCS mål signalmolekyler nedstrøms for calciumindløb. På grund af vigtigheden af ​​calcium signalering i mange immunologiske og andre biologiske processer, kunne TCS potentielt have negative virkninger på en lang række af de nødvendige biologiske processer. Faktisk viste Udoji et al. ^39. at FKS undertrykker menneskets naturlige dræberceller celle lytisk aktivitet, en anden vigtig medfødte immunforsvar.

Beyond sit potentiale som en terapeutisk hjælp i allergisk sygdom (eller omvendt, som immunotoxicant), kan FKS også være hormonforstyrrende ^40-49. Således er en klar procedure om, hvordan man forbereder denne kemiske i opløsning is af interesse for toksikologer. Fordi TCS er en lille hydrofob molekyle anvendes organiske køretøjer ofte bruges til at gøre det mere opløseligt i vand. I de fleste toksicitetsundersøgelser hvor FKS er blevet testet, har forberedelse involveret opløsning i vand ved hjælp af et organisk opløsningsmiddel, såsom ethanol, acetone, eller olie ^2,50,51. Men ofte gange disse opløsningsmidler er biologisk aktive selv, og derved komplicerer fortolkningen af teststoffet data ^51.. Faktisk. Ifølge Rufli m.fl. ⁵² og andre ^53, anbefales det at afprøve løsninger på akvatiske toksicitet eksperimenter fremstilles ved hjælp af fysiske metoder løbet kemiske metoder, på grund af muligheden af kemiske opløsningsmidler til at skabe toksicitet artefakter. Vi har tidligere vist, at FKS opløst i 0,24% ethanol / vand (vol / vol) og sonikeret i 30 min dæmper RBL mastcelledegranulering ^2. Ethanol ved højere koncentrationer end 0,24% har vist sig at dæmpe mastcelle nedbrydningennulation ^{54,55-eksempler} på de potentielt forstyrrende virkninger af organiske opløsningsmidler på toksicitetsundersøgelser.

Ikke alene er det vigtigt at overveje effekten af ​​opløsningsmidler på organisme eller celler, der anvendes for at studere, men også det er vigtigt at overvåge effekten af ​​et opløsningsmiddel på testkemikaliet selv. For eksempel Skaare et al. ⁵¹ syntes at opløse FKS i polyethylenglycol (almindeligvis findes i tandpasta og mundskyl) svækket anti-bakteriel og anti-plak effekter i raske kvindelige kvinder, mens opløsning i olier forårsagede en fuldstændig tab af funktion. Derfor, at evnen af ​​forskellige opløsningsmidler modulere giftstof og narkotika, herunder FKS, bør virkninger tages i betragtning i assay design. Anvendelse af olier eller smagsstoffer kan forstyrre virkningen af FKS i forskellige produkter ^50,51.

I et forsøg på at eliminere behovet for at anvende organiske opløsningsmidler, forbedrede vi ved vores metode til opløsning af TCS ² ved at eliminere brugen af en organisk sollufte. I den nuværende protokol, opløses vi FKS granulat direkte i vandig buffer med varme (≤ 50 ° C), og derefter kontrollere koncentrationen af ​​dette TCS lager ved UV-Vis spektrofotometri. Disse forbedringer er mulige, fordi TCS er opløseligt i vand op til 40 uM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ), og har vist sig at modstå nedbrydning, når det opvarmes til 50 ° C ( http / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. Vi har også den ekstra fordel af UV-Vis spektrofotometri, som TCS også er kendt for at kraftigt absorberer ved 280 nm ⁵⁸ med en molær ekstinktionskoefficient på 4.200 L / mol / cm ^12.

Denne protokol giver en enkel, men effektiv måde at opløse FKS granulat i en buffer uden hjælp af et organisk opløsningsmiddel, herunder lave omkostninger og hurtig kontrolkoncentration, beskriver og en kraftig fluorescerende mikroplade assay til overvågning kemiske virkninger på mastcelledegranulering.

Protocol

Bemærk at alle buffer opskrifter indgår i en tabel i slutningen af protokollens tekst. Dag 1: 1.. Fremstilling af celler Planlægge ud 96-brønds plade setup ordningen centrering prøver på layoutet for at undgå kantvirkninger. Allocate tre gentagelser for hver FKS koncentration testet (± degranulering stimulans af antigen eller ionophor), samt triplikater for spontan frigivelse (ingen degranulering stimulerende), maksimal frigivelse (…

Representative Results

Når det opvarmes til 50 ° C i 90 min, UV-Vis absorbansspektrum for FKS frembringer en stærk, jævn kurve mellem ~ 260 og 300 nm, med en top ved 280 nm, som vist i figur 1. UV-Vis spektrofotometri er derfor et vigtigt redskab, der kan anvendes til at beregne koncentrationen, da den offentliggjorte molære absorptionskoefficient ved 280 nm er 4,200 l / mol / cm 12. Vi har konstateret, at FKS ikke falder ud af opløsning i løbet af tidsrammen for hele degranulering eksperimentet, efter 50 ° C varme (data ikke v…

Discussion

I 2004 udviklede NAAL et al. ¹ a mast celle biosensor til high-throughput test af degranulering. Det er en robust analyse, som vi har tilpasset til vores FKS studier og udførligt beskrevet i denne video. Forud for NAAL et al. ^1. assay havde mastcelledegranulering rutinemæssigt blevet vurderet via β-hexosaminidase ^59-61, men disse tidlige metoder udnyttes fluorometre, hvor en prøve blev læst på et tidspunkt. Vigtigere er det, NAAL et al. etableret direkte overensstemmelse mell…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene