En mikroplatta analys för att bedöma Kemiska Effekter på RBL-2H3 mastcelldegranulering: Effekter av Triclosan utan användning av ett organiskt lösningsmedel

Summary

Mastcelldegranulering, frigivning av allergiska mediatorer, är viktig i allergi, astma, och parasit försvar. Här visar vi tekniker ¹ för bedömning effekterna av droger och gifter om degranulering, metodik användes nyligen för att uppvisa den kraftfulla hämmande effekten av antibakteriellt medel triclosan ^2.

Abstract

Mastceller spelar viktiga roller i allergisk sjukdom och immunförsvaret mot parasiter. När det är aktiverat (t.ex. av ett allergen), de Degranulate, en process som resulterar i exocytos av allergiska mediatorer. Modulering av mastcelldegranulering av droger och gifter kan ha positiva eller negativa effekter på människors hälsa. Mast cellfunktionen har dissekerats i detalj med användning av råtta basofila leukemiceller mast (RBL-2H3), en allmänt accepterad modell av humana mukosala mastceller ^3-5. Mast cell granul komponent och den allergiska medlare β-hexosaminidas, som frisätts linjärt parallellt med histamin från mastceller ^6, kan lätt och tillförlitligt mätas genom reaktion med ett fluorogent substrat, vilket ger mätbar fluorescensintensitet i en mikroplatta analys som är mottaglig för hög genomströmning studier ^1. Ursprungligen publicerad av Naal et al. ^1, har vi anpassat denna degranulation analys för screening of droger och gifter och tydligt visar dess användning här.

Triclosan är ett brett spektrum antibiotikum som finns i många konsumentprodukter och har visat sig vara ett terapeutiskt stöd i mänsklig allergisk hudsjukdom ^7-11, även om mekanismen för denna effekt är okänd. Här visar vi en analys för effekten av triclosan på mastcelldegranulering. Vi visade nyligen att triclosan påverkar starkt mastcell funktion ^2. I ett försök att undvika användningen av ett organiskt lösningsmedel, är triklosan upplöses direkt i vattenhaltig buffert med värme och omröring och resulterande koncentration bekräftas med användning av UV-Vis-spektrofotometri (med användning ε ₂₈₀ = 4200 L / M / cm) ^12. Detta protokoll har potential att kunna användas med en mängd olika kemikalier för att bestämma deras effekter på mastcelldegranulering, och mer allmänt, deras allergiska potential.

Introduction

Mastceller starkt granulerade immuneffektorceller som fungerar som viktiga mediatorer vid astma, allergier, parasit försvar och cancer ^13-16. De bor i nästan varje vaskulariserad vävnad ^15, där de säkert lagra allergiska och inflammatoriska mediatorer i cytoplasmiska granulat tills aktiverat för att Degranulate. Degranulering är exocytos av membranbundna granulat, vilket resulterar i frisättning av farmakologiskt aktiva mediatorer såsom histamin, tryptas, och leukotriener ^15. Denna process resulterar i initiering av typ I överkänslighetsreaktioner som är kritiska för montering försvar mot parasiter samt initiera allergiska, astmatiska och cancerframkallande svar ^15.

Mastceller och basofiler uttrycker FceRI receptorer, med hög affinitet receptorer för immunoglobulin E (IgE) ^17. Exponering för ett allergen eller antigen orsakar aggregering av flera IgE-bundna FcsRI receptorer ^17, och det är denna sektionO-kallas "tvärbindning" av IgE-bundna Fc-receptorer som initierar degranulering processen: en kaskad av tyrosinfosforylering händelser, aktivering av fosfolipas C, utflödet av kalcium från interna affärer, och inflöde av kalcium i cellen ^18. Denna kalciuminflöde är nödvändig för degranulering, och vidare signalerar granul fusion med membranet innan orsaka granul exocytos ^15. Experimentellt kan en kalciumjonofor användas till pendeltrafik kalcium direkt över cellmembranet ^19, som i huvudsak kringgår alla signaltransduktion steg före kalciuminflöde steg ^20, vilket möjliggör identifiering av en bana målet med ett gift som uppströms eller nedströms kalcium signalering ^20.

Degranulering kan mätas snabbt och effektivt genom att övervaka frisättningen av β-hexosaminidas in cellsupernatant, som frisätts linjärt från granulerna vid sidan histamin ^6, men jagär mycket lättare att upptäcka med hjälp av en enkel enzym-substrat reaktion och en mikroplattavläsare för analys av fluorescerande produkt. Denna mikroplatta analys såsom beskrivs i protokollet avsnittet, är baserad på en robust metod som ursprungligen utvecklades av Naal et al. ^1, som kvantifierar klyvning av det fluorogena substratet 4-metylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid med β- hexosaminidas. Vi har modifierat analys för att testa effekterna av droger och gifter, med triclosan lyfts fram här. Denna metod tillförlitligt kvantifierar degranulation, är ett billigt alternativ till, exempelvis flödescytometrisk-baserade detektionsmetoder ^21, och har potential att ge sig fint till high-throughput screening av ett brett utbud av anti-allergi droger, liksom immunotoxiskt eller allergena kemikalier. Denna sista punkt är särskilt viktigt mot bakgrund av 2007 års National Research Council rapport "kemikalieprövning i ^{21: a} århundradet: en vision och en StrataEGY "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), som förespråkar för utvecklingen av high-throughput toxikologitester som använder cellodling att minska kostsamma användningen av traditionella försöksdjur som möss. Den degranulering protokoll som utvecklats av Naal et al. ^Ett och modifieras av oss ^2, utnyttjar RBL-2H3-cellinje, som är en väl-accepterad modell homolog med humana mukosala mastceller eller basofiler ^3-5. (Metoder för odling av RBL-2H3 celler beskrivs i Hutchinson et al. ^22). Denna analys skulle sannolikt anpassas till alla bifogade mast celltyp.

Triclosan (TCS) är ett brett spektrum antimikrobiella som har använts i mer än 30 år på sjukhus, hygienartiklar och konsumentvaror ^23,24. Verkningsmekanismen för TCS antimikrobiella egenskaper är hämningen av fettsyror biosyntes, sannolikt genom att hämma enoyl-acylbärarprotein reduktas ^25,26. Den finns över hela världen i ett brett spektrum av konsumentprodukter som dusch gel, handlotion, tandkräm, munvatten, och i hand tvål vid koncentrationer upp till 0,3% eller 10 mM ^24. Utbredd användning av TCS har resulterat i detekterbara halter i människor ^27-29 och i floder och vattendrag ^30. En studie utförd av Allmyr et al. ²⁷ visade att TCS och dess metaboliter finns i både plasma och mjölk från ammande mödrar. Viktigt är TCS lätt absorberas in i huden ^{31 till 37.} Queckenberg et al. ³⁷ hittade ~ 10% absorption av en ~ 70 mM TCS grädde i mänsklig hud inom 12 timmar, vilket betydande koncentration i huden, där mastceller bor.

TCS har visats kliniskt för att hantera mänsklig allergisk hudsjukdom ^7-11, men den mekanism med vilken TCS lindrar allergiska hudsjukdomar har varit okänt ^38. Använda fluorescerande detaile mikroplattan assayd i den här videon, visade vi nyligen att TCS, vid koncentrationer så låga som 2 iM, avsevärt dämpar mast cell funktion och degranulering, vilket ger en möjlig förklaring till dessa kliniska data ^2. Förutom att ge en förklaring till dessa kliniska data, våra resultat i Palmer et al. ² antyder att TCS riktar signalmolekyler nedströms av kalciuminflöde. På grund av vikten av kalcium signalering i många immunologiska och andra biologiska processer, kan TCS ha potentiellt negativa effekter på ett brett utbud av nödvändiga biologiska processer. I själva verket visade Udoji et al. ³⁹ som TCS undertrycker mänskliga naturliga mördarceller lytisk aktivitet, en annan viktig medfödda immunförsvar.

Bortom dess potential som ett terapeutiskt stöd allergisk hudsjukdom (eller, omvänt, som immunotoxicant), kan TCS också vara hormonstörande ^40-49. Således, ett tydligt förfarande för hur man förbereder denna kemikalie i lösning is av intresse för toxikologer. Eftersom TCS är en liten hydrofob molekyl, är organiska fordon används ofta för att göra den mer löslig i vatten. I de flesta toxicitetsstudier där TCS har testats, har beredningen involverad upplösning i vatten med hjälp av ett organiskt lösningsmedel, såsom etanol, aceton eller olja ^2,50,51. Men ofta gånger dessa lösningsmedel är biologiskt aktiva själva, vilket komplicerar tolkningen av testet kemiska data ^51. I själva verket, enligt Rufli et al. ⁵² och andra ^53, rekommenderas att testa lösningar för akvatisk toxicitet experiment framställs med hjälp av fysikaliska metoder under kemiska metoder, på grund av risken för kemiska lösningsmedel för att skapa toxicitet artefakter. Vi har tidigare visat att TCS upplöst i 0,24% etanol / vatten (vol / vol) och sonikerades under 30 min dämpar RBL mastcelldegranulering ^2. Etanol vid högre koncentrationer än 0,24% har visat sig dämpa mastcell nedbrytningnulation ^{54,55-exempel} på potentiellt störande effekter av organiska lösningsmedel i toxicitetsstudier.

Inte bara är det viktigt att ta hänsyn till effekten av lösningsmedel på organismen eller celler som används för studien, men också att det är viktigt att övervaka effekterna av ett lösningsmedel på testkemikalien själv. Till exempel, Skaare et al. ⁵¹ tyckte att lösa TCS i polyetylenglykol (vanligt förekommande i tandkräm och munvatten) försvagades anti-bakteriella och anti-plack effekter i friska kvinnliga kvinnor medan upplösningen i olja orsakade en total förlust av funktion. Därför kan förmågan hos olika lösningsmedel modulera giftämne och läkemedel, inklusive TCS bör effekter behandlas i analysutformning. Användning av oljor eller tillsatser smak kan störa effekten av TV-kamerasystem i olika produkter ^50,51.

I ett försök att eliminera behovet av att använda organiska lösningsmedel, förbättrade vi vid vår metod för att lösa TCS ² genom att eliminera användningen av en organisk solventilera. I det nuvarande protokollet, upplösa vi TCS granulat direkt i vattenlösning buffert med värme (≤ 50 ° C), och sedan kontrollera koncentrationen av denna TCS lager med UV-Vis-spektrofotometri. Dessa förbättringar är möjliga eftersom TCS är löslig i vatten upp till 40 ^ M ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) och har visats att motstå nedbrytning vid uppvärmning till 50 ° C ( http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. Vi har också den ytterligare fördelen med UV-VIS-spektrofotometri, som TCS även känt att starkt absorberar vid 280 nm ⁵⁸ med en molär extinktionskoefficient av 4200 L / mol / cm ^12.

Detta protokoll ger en enkel men effektivt sätt att lösa TCS granulat i en buffert utan hjälp av ett organiskt lösningsmedel, inklusive låg kostnad och snabb verifieringav koncentration, beskriver och en kraftfull fluorescerande microplate analys för övervakning av kemiska effekter på mastcelldegranulering.

Protocol

Observera att alla buffert recept ingår i en tabell i slutet av protokollet text. DAG 1: Ett. Beredning av celler Planera ut 96-väl systemet plattan setup, centrering prover på layouten för att undvika kanteffekter. Allokera tre replikat för varje TCS koncentration testad (± degranulation stimulerande av antigen eller jonofor), samt tre exemplar för spontan frisättning (ingen degranulation stimulerande), maximal frisättning (0,2% T…

Representative Results

Vid uppvärmning till 50 ° C under 90 min, producerar UV-Vis absorbans spektrum för TCS en stark, mjuk kurva mellan ~ 260 och 300 nm, med en topp vid 280 nm, såsom visas i figur 1. UV-Vis-spektrofotometri är därför ett viktigt verktyg som kan användas för att beräkna koncentrationen, eftersom publicerade molära absorptionskoefficienten vid 280 nm är 4,200 L / mol / cm 12. Vi har funnit att TCS inte faller ut ur lösningen under tidsramen för hela degranulering experimentet, efter 50 ° C uppvärmning …

Discussion

Under 2004 utvecklade Naal et al. ¹ en mast cell biosensor för hög genomströmning testning av degranulering. Det är en robust analys som vi har anpassat för våra TCS studier och som beskrivs i den här videon. Före Naal et al., ^1-analysen hade mastcelldegranulering har rutinmässigt bedömts via β-hexosaminidas ^59-61, men dessa tidiga metoder utnyttjade fluorometrar i vilka ett prov lästes i taget. Viktigt Naal et al. upprättas direkt överensstämmelse mellan deras mer h…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene