定量的な<em>インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために>アッセイ
Summary
感染部位における活性化内皮への好中球の順守は、ホストの炎症反応に不可欠なコンポーネントです。を可能にした好中球結合アッセイは、この報告書に記載<em> in vitroで</em静的な条件下での炎症性メディエーターによって活性化内皮細胞への結合初代ヒト好中球の>定量。
Abstract
血管内皮は、炎症反応に不可欠な役割を果たしている。炎症の急性期の間に、内皮細胞（ECの）保存された微生物成分又は宿主由来の危険分子による宿主メディエーター直接によって活性化される。活性化されたECの特急サイトカイン、動員ケモカインおよび接着分子は、感染症やけがの部位で白血球を活性化し、維持する。好中球は到着する最初の白血球であり、両方の細胞の表面に存在する接着分子のさまざまな内皮に付着する。好中球の主な機能は、直接、微生物の脅威を除去するための追加の因子の放出を介して他の白血球の動員を促進し、創傷修復を開始することである。したがって、内皮への採用とアタッチメントは、炎症応答の開始に重要なステップです。本稿では、用いたin vitro好中球接着アッセイで説明カルセインAM-標識された一次ヒト好中球は、静的条件下で微小血管内皮細胞の活性化の程度を定量する。この方法は、蛍光分光光度計で定量し、同じサンプルは、直接結合好中球のより定性的評価のために蛍光顕微鏡を用いて可視化することができるというさらなる利点を有する。
Introduction
血管内皮の循環血液と直接接触しているので、一意的に感染または損傷時に迅速な炎症反応を開始させる位置している。内皮細胞（ECS）の保存された細菌成分と危険分子の多様性、ならびにTNFαなどの炎症性メディエーターホストに対する受容体を認識する明白なパターン認識受容体。これらの受容体の活性化は、分泌性サイトカイン（ 例えば、IL-6、IL-8、CXCL1およびCCL2）へのECを誘導し、そしてその細胞表面1の接着分子（ 例えば、E / P-セレクチン、VCAM-1およびICAM-1）をアップレギュレートする、2。これらの分子は、すべての感染性病原体の宿主をクリアし、組織修復を3,4を開始するために感染や傷害部位への白血球の局在を促進する。感染に好中球応答が血管内皮と応答の間でよく調整された相互作用を伴う好中球。 EC活性化、ILアポン8が分泌され、感染症やけが5,6のサイトに家に好中球を可能に内皮に血管内の勾配を形成する。 E / P-セレクチン好中球の取り込みを仲介し、好中球の細胞表面上にglycomoleculesと比較的弱い団体を通じてローリング。これらの相互作用は、その同族受容体へのIL-8結合とともに、堅牢な、インテグリン媒介アタッチメントおよび内皮細胞表面7-10に好中球の最終的な逮捕を容易にします。停止した後、好中球は、直接病原体を排除するために、感染の特定の部位への脈管構造から移動病原体の拡散を防ぐために好中球細胞外トラップを生成し、創傷治癒を促進し、単球、マクロファージおよび樹状などの他の白血球を補充する追加の因子を放出することができ細胞11-17。
microvへの好中球の接着を定量するためのインビトロ方法は、この報告書に記載ascularはTNFα宿主炎症性メディエータによる活性化した後にECを。このアッセイは、ECの活性化のではなく、好中球を評価するために設計されている。初代ヒト好中球は、第密度勾配分離を用いて単離され、次いで、カルセインアセトキシメチル（AM）で標識される。生細胞加水カルセイン内エステラーゼは、492から495 nmおよび513から516 nmの18の放射の励起と高蛍光カルセイン分子にAM。蛍光標識された好中球は、その後、EC単層と共にインキュベートし、非付着性好中球は、その後、除去される。残りの結合した好中球の蛍光は、その後、蛍光分光光度計を用いて測定し、ウェルあたりの総好中球の蛍光入力のパーセントとして計算される。この方法は、分光光度法で使用される結合したカルセイン-標識された好中球を直接より定性的なEC交流から読み出さを与えるために蛍光顕微鏡を用いて可視化することができるというさらなる利点を有するtivation。このアッセイは、静的条件下で行われるので、好中球の接着カスケードに生じるごく初期のイベントが評価される。これは、そのE-セレクチンとの相互作用が中断されたときTNFα処理ヒト肺微小血管EC（HMVEC-肺）単層への好中球の順守を大幅に低減されることを示すために、E-セレクチン遮断抗体を使用して、この報告書で確認された。
TNFαに加えて、我々は正常Toll様受容体1/2アゴニストペプチドグリカン関連リポタンパク質（PAL）、ムレインリポタンパク質（MLP）とPam3Cysによってヒト臍帯静脈EC（HUVEC）活性化の程度を決定するために、このアッセイを使用しているPam3Cys 19,20によってHMVEC-肺の活性化。さらに、我々は正常にこの方法論は、さまざまな互換性があることを示唆し、キナーゼ阻害剤とHMVEC-肺における表面および細胞質タンパク質のRNAiによるノックダウンした後に、このアッセイを使用した生化学的およびscreeninグラムアッセイ20。要約すると、このアッセイは、in vitroで炎症性メディエーターによってECの活性化の程度にアクセスするため、使いやすい、再現性、より機能的な方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功した好中球/微小血管内皮細胞接着アッセイのための最も重要なステップは次のとおりである：1）低継数（<9）、健康な内皮細胞の使用は、低密度（ すなわち <5×10 6個の細胞で孤立した好中球を維持2） / ml）と分離の2時間以内にそれらを使用して、それぞれ、3）気難しいカルセインAMで標識された好中球の洗浄および好中球からのカルセインのECの汚染や損失を最小限…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、麻酔と周術期ケアのUCSF学科によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
Referências
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
