Kvantitativ<em> In vitro</em> Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser
Summary
Nøytrofile tilslutning til aktivert endotel på nettstedene til infeksjon er en integrert del av vertens inflammatorisk respons. Beskrevet i denne rapporten er en nøytrofile bindingsanalyse som gir mulighet for<em> In vitro</em> Kvantifisering av primær menneskelig nøytrofile binding til endotelceller aktiveres av inflammatoriske mediatorer under statiske forhold.
Abstract
Blodåreendotelets spiller en vesentlig rolle i den inflammatoriske respons. I den akutte fasen av betennelse, er endotelceller (ECS) aktiveres av vert meklere eller direkte av konserverte mikrobielle komponenter eller host-avledet fare molekyler. Aktiverte egenkapitalbevis uttrykke cytokiner, chemokiner og adhesjonsmolekyler som mobiliserer, aktivere og beholde leukocytter på stedet av infeksjon eller skade. Nøytrofile granulocytter er de første leukocytter å ankomme, og holder seg til endotelet gjennom en rekke adhesjonsmolekyler tilstede på overflaten av begge celler. De viktigste funksjonene til nøytrofile er å direkte eliminere mikrobielle trusler, fremme rekruttering av andre leukocytter gjennom utgivelsen av flere faktorer, og initiere sår reparasjon. Derfor er rekruttering og vedlegg til endotelet et kritisk punkt i initiering av den inflammatoriske respons. I denne rapporten beskriver vi en in vitro nøytrofile vedheft analysen hjelpCalcein AM-merket primære humane neutrofiler til å kvantifisere omfanget av mikrovaskulær endotelial celleaktivering under statiske forhold. Denne metode har den ytterligere fordel at de samme prøvene kvantifisert ved fluoresens-spektrofotometri kan også visualiseres direkte ved hjelp av fluorescens-mikroskopi for en mer kvalitativ vurdering av nøytrofil binding.
Introduction
Siden det vaskulære endotel er i direkte kontakt med det sirkulerende blod, er det en unik plassert for å initiere en hurtig inflammatorisk respons under infeksjon eller skade. Endotelceller (ECS) uttrykte mønstergjenkjenning reseptorer som gjenkjenner en rekke bevarte bakterielle komponenter og fare molekyler, og reseptorer for vert inflammatoriske mediatorer som TNF-alfa. Aktivering av disse reseptorene ECS å utskille cytokiner (for eksempel IL-6, IL-8, CXCL1 og CCL2), og å oppregulere adhesjonsmolekyler (f.eks E / P-selektin, VCAM-1 og ICAM-1) på deres celleoverflate ett , 2.. Disse molekylene alt til rette for lokalisering av leukocytter til nettsteder for infeksjon og skade for å fjerne vert for smittestoffer og initiere vev reparasjon 3,4. Den nøytrofile responsen på infeksjon innebærer en godt koordinert samspill mellom blodåreendotelets og svarer nøytrofile. Ved EF-aktivering, IL-8 utskilles og danner en intravaskulær gradient på endotelet som gjør at nøytrofile hjemme på stedet for infeksjon eller skade 5,6. E / P-selectins megle nøytrofile fangst og rulle gjennom relativt svake assosiasjoner med glycomolecules på nøytrofile celleoverflaten. Disse interaksjonene, sammen med IL-8 binding til sine beslektede reseptorer, lette robust, integrinantistoff-mediert vedlegg og eventuell arrestasjon av nøytrofile på endotelceller overflaten 7-10. Etter arrestasjonen, kan nøytrofile migrere ut av blodkar til de spesifikke områder av smitte til direkte eliminere patogener, generere nøytrofile ekstracellulære feller for å hindre spredning av patogener, fremme sårheling og utgi flere faktorer som rekrutterer andre leukocytter som monocytter, makrofager og dendrittiske celler 11-17.
Beskrevet i denne rapporten er en in vitro metode for å kvantifisere nøytrofile tilslutning til microVascular egenkapitalbevis etter aktivering av verten inflammatorisk megler TNF-alfa. Denne analysen er laget for å vurdere aktivering av egenkapitalbevis, og ikke nøytrofile. Primære humane neutrofiler er først isolert ved hjelp av densitetsgradient separasjon, og blir deretter merket med Calcein acetoksymetyl (AM). Esterasene innenfor levende celler hydrolyze Calcein AM til den svært fluorescerende Calcein molekyl med en eksitasjon av 492-495 nm og utslipp av 513-516 nm 18. De fluorescently-merket nøytrofile blir deretter inkubert med EF monolagene, og ikke-heftende nøytrofile senere blir fjernet. Fluorescensen av de gjenværende, bundne nøytrofiler blir så målt ved hjelp av et fluorescens-spektrofotometer, og beregnes som en prosent av total neutrofil fluorescens inndata per brønn. Denne metode har den ytterligere fordel at de bundne Calcein-merkede nøytrofiler som brukes i spektrofotometri direkte kan visualiseres ved hjelp av fluorescens-mikroskopi for å gi en mer kvalitativ lest ut av EC acaktiverings. Siden denne analysen er utført under statiske forhold, vil bare de aller første hendelser som oppstår i nøytrofile vedheft kaskade bli vurdert. Dette bekreftes i denne rapporten bruker E-selektinantistoffer blokkerende antistoffer for å vise at nøytrofile tilslutning til TNF-alfa-behandlet menneskelig lunge microvascular EC (HMVEC-Lung) monolagene er drastisk redusert når samspillet med E-selectin blir forstyrret.
I tillegg til TNF-alfa, har vi med hell brukt denne analysen for å fastslå omfanget av menneskelig umbilical vein EC (HUVEC) aktivering av Toll-like receptor 1/2 agonister peptidoglycan-assosiert lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) og Pam3Cys og HMVEC-Lung aktivering av Pam3Cys 19,20. I tillegg har vi med hell brukt denne analysen med kinase hemmere og etter RNAi-mediert knockdown av overflaten og cytoplasmatiske proteiner i HMVEC-Lung, som tyder på at denne metodikken er kompatibel med en rekke biokjemiske og screening-analyser 20. Oppsummert gir denne analysen en lett å bruke, reproduserbar, mer funksjonell måte å få tilgang til omfanget av EC aktivering av inflammatoriske mediatorer in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trinn for en vellykket neutrofil / mikrovaskulær endotelcelle-adhesjon analysen er: 1) Anvendelse av lav passasje nummer (<9), sunne endotelceller, 2) opprettholdelse av de isolerte nøytrofiler ved en lav tetthet (dvs. <5 x 10 celler 6 / ml) og bruker dem innen to timer med isolasjon, og 3) Smakfullt vask av Calcein AM-merket nøytrofile og bruk av Calcein AM-merket nøytrofile i tide for å minimere EC forurensning og tap av Calcein fra de nøytrofile, henholdsvis .
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av UCSF Institutt for anestesi og Perioperative Care.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
Referências
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
