En protokoll er beskrevet som bruker Illumina er infinium analyser for å utføre storskala genotyping. Disse analysene kan sikkert genotype millioner av SNPs over hundrevis av individuelle DNA-prøver i tre dager. Når generert, kan disse genotyper brukes til å sjekke for assosiasjoner med en rekke forskjellige sykdommer eller fenotyper.
Genotyping varianter i det menneskelige genom har vist seg å være en effektiv metode for å identifisere genetiske assosiasjoner med fenotyper. Fordelingen av varianter innenfor familier eller populasjoner kan lette identifikasjon av genetiske faktorer for sykdom. Illumina panel av genotyping BeadChips tillater etterforskere genotype tusenvis eller millioner av single nukleotid polymorfismer (SNPs) eller å analysere andre genomisk varianter, for eksempel kopi nummer, på tvers av et stort antall DNA-prøver. Disse SNP'er kan være spredt over hele genomet eller målrettet i bestemte områder for å maksimere potensial oppdagelse. Den infinium analysen har blitt optimalisert for å gi høy kvalitet og nøyaktige resultater raskt. Med riktig oppsett, kan en enkelt tekniker behandle fra noen hundre til over tusen DNA-prøver per uke, avhengig av hvilken type array. Denne analysen leder brukerne gjennom hvert trinn, og starter med genomisk DNA og slutter med skanning av tabellen. Ved hjelp av anstendighet reagents, er prøvene forsterket, fragmentert, utfelt, resuspendert, hybridisert til chip, forlenges med et enkelt base, farget, og skannet på enten en iScan eller Hi Scan høyoppløselig optisk imaging system. En natten over trinnet er nødvendig for å forsterke DNA. DNA er denaturert og isotermisk forsterket av hel-genomet forsterker, og derfor er det ikke nødvendig for PCR. Prøvene hybridiseres til de matriser under et andre trinn over natten. Ved den tredje dagen, prøvene er klare til å bli skannet og analysert. Forsterket DNA kan bli lagret i store mengder, slik at kule matriser som skal behandles hver dag i uken, og maksimerer gjennomstrømning.
Skrive single nukleotid polymorfismer (SNPs) er en viktig metode for å identifisere risiko varianter assosiert med sykdom. Historisk har omfanget av genotyping eksperimenter vært begrenset av tilgjengelig teknologi. Gel elektroforese-baserte metoder for genotyping er begrenset i sample-og SNP-throughput [1]. Utvikling av disse analysene kan ofte være arbeidskrevende, avhengig av sminke og strukturen i regionen rundt variant for optimalisering [1]. TaqMan genotyping-analyser utviklet av Life Technologies, kan kjøre et stort antall prøver raskt og med minimal involvering tekniker [2], men SNP-multipleksing begrensninger fortsette å begrense det totale antall genotyper til godt under millioner per dag [3,4 ]. Sequenom sin iPlex plattformen kan også kjøre mange prøver på en gang, men, som færre enn hundre SNPs kan multiplekset sammen, er gjennomstrømningen forholdsvis lav samlet [5]. Beckman Coulter SNP stream teknologikan teoretisk produsere over tre millioner genotyper per dag, men dette teknologigrenser prosjektet utvalg til et maksimum bare førtiåtte SNPs per reaksjon [4,6]. Mens Golden analysen kan behandle nesten to hundre DNA-prøver hver dag på hundrevis eller tusenvis av SNPs per prøve, er prisen per genotype ikke konkurransedyktig med avanserte, ultra-high-throughput teknikker når du skriver over tre tusen SNPs på en gang [4,7 ]. For å kunne behandle flere millioner genotyper per dag, omfanget som kreves for store genome-wide forening studier, har matrise-hybridiseringsbestemmelser blitt den mest kostnadseffektive alternativet på markedet.
Affymetrix linje av hybridisering arrays og Illumina linje av infinium-baserte arrays tillate potensielt hundrevis av prøver å være skrevet på hundretusener eller millioner av SNPs parallelt [4,8]. Disse SNP'er kan være spredt over hele genomet, lokalisert i områder av interesse, for eksempel exomes, eller tilpasses til brukerens preferanser. Disse arrays har fordelen av å ikke bare være i stand til å nøyaktig genotype en million SNPs per prøve på en gang, men også for å måle kopi nummer variasjon, potensielt avduking kromosomavvik. Infinium-justert OMNI BeadChip arrays nå har muligheten til å genotype opp til nesten fem millioner markører per prøve, inkludert en halv million tilpasset loci, på opp til nesten hundre prøver hver dag.
Som de fleste sykdommer har en genetisk komponent, kan disse store eksperimenter være avgjørende i å finne gener assosiert med sykdom. Høy gjennomstrømming genotyping muliggjør effektiv genotype generasjon i utvalget setter stor nok til å overbevis oppdage genetisk tilknytning ved lavere mindre allelfrekvensene. Hel-genom genotyping prosjekter kan brukes til å finne områder med statistisk signifikant case-control allel frekvens eller kopi nummer forskjeller [9,10,11]. Ifølge National Menneskelig Genome Research Institute, genome-wide forening studier førte til 1490 separate publikasjoner mellom 25 november 2008 og 25 januar 2013, som stammer fra oppdagelsen av 8283 SNPs med en p-verdi mindre enn 1 x 10 -5 (se http:// www.genome.gov/gwastudies/). Disse studiene, som forsket på forhold som strekker seg fra høyden til testikkelkreft, dratt nytte av den brede tilnærmingen gis av et genom-wide analyse. I tilfeller som disse, kan hele regioner av interesse har rømt varsel hadde omfanget av å skrive vært for restriktive. Således, for storskala krets analyser, er en genom-wide genotyping teknikk teknikken for valget.
Forskjellige versjoner av den infinium assay eksisterer, hvert beregnet for bruk sammen med spesielle typer matriser. Den InfiniumUltra analysen, grundig drøftet nedenfor, er passende for mange 12 – eller 24-sample array-chips. Disse ofte genotype over hundre tusen SNPs per DNA-prøve og fokusere på targeted regioner, slik som på exome eller tilpassede paneler. Andre analyse versjoner kan være nødvendig for andre typer chips, slik som hel-genom genotyping matriser. Men som alle infinium analyser dele et felles grunnlag og hovedsakelig skiller bare av reagensnavn, de reagensvolumene, eller den nøyaktige fargereagens prosedyre, teknikker perfeksjonert på én analyse versjon kan ofte være universelt brukt. Andre matriser, slik som metylering matriser, kan bruke en nesten identisk protokoll, så vel. Hensyn må tas til bare å bruke versjonen av analysen som kreves for brikketype i bruk. Noen typer, som for eksempel de som måler genekspresjon nivå, kan kreve bruk av en nonInfinium protokollen.
Prøvene må behandles i grupper. For eksempel, med InfiniumUltra assay, prehybridization reagensrør inneholde nok volum til å kjøre 96 prøver, og rørene kan ikke fryses igjen. Derfor må prøvene kjørt i grupper på 96 prøver om gangen. Prøvene vil bli forsterket på granert dag. Etter omtrent 1 time for benchwork, må prøvene oppvarmes i en konveksjonsovn for 20 til 24 timer. Den følgende dag, vil nesten 4 hr bli brukt fragmentering, utfelling, og risting av prøvene, noe som medførte at prøvene kan enten bli frosset for senere bruk eller hybridisert til brikken. Last chips tar nesten 2 timer, hvoretter prøvene blir hybridisert over natten i 16-24 timer. På den tredje dag, tar farging og forlengelsen trinnet ~ 4 hr. En ytterligere time blir brukt vasking, belegg, og tørking av flisen. Endelig er de matriser skannet, noe som kan ta 15-60 min / chip, avhengig av den type som anvendes.
Forholdsregler standard laboratorium sikkerhet og renslighet gjelder. Selv om forsterkningen er ikke PCR-basert, separate arbeidsstasjoner for pre-og postamplification prosedyrer er nødvendige for å minimere sannsynligheten for forurensning. Identifikasjonsnummeret til hver kit levert reagens i bruk må være logget inn for en sporing ark. ReageNTS skal ikke tines umiddelbart før bruk og invertert flere ganger før dispensering. Det DNA som skal skrives må være av høy kvalitet genomisk DNA (260/280 absorbans-forhold på 1,6 til 2,0, 260/230 absorbans-forhold av under 3,0), isolert ved hjelp av standardmetoder, og kvantifisert med et fluorometer. Nedbrytning av DNA er ofte en medvirkende årsak til lav kvalitet analyseresultatene. Typisk blir 200 ng av DNA som kreves, selv om denne mengde kan variere i noen chip typer. En Tecan væske-håndtering robot kan automatisere mange skritt i protokollen og redusere menneskelige feil som en faktor.
Storskala genotyping applikasjoner har blitt brukt til å bedre forstå den genetiske mekanismen bak mange menneskelige sykdommer. Oppdagelsen av noen betydelig variant gjennom et genom-wide forening analyse kan flagge en kandidat region for videre studier. I tillegg er genotype data et godt verktøy for kvalitetskontroll på sekvense prosjekter.
For å maksimere prøvekapasitet, kan flere prøveplater bli forsterket og lagret i deres fragmenterte, resuspendert stater. Åtte plater kan forsterkes på en enkelt dag, ved å kombinere de første 24 timer av protokollen for flere grupper, og som gir tilstrekkelig materiale for ~ 2-8 dager med chip-behandling. Hvis forsterkede plater ligger lagret på forhånd, og dersom nye prøver er hybridisert til chips umiddelbart etter skanning begynner på forrige løp, kan behandlingen kjøres kontinuerlig uten behov for å ta en pause for ytterligere prøveopparbeidelse. Derfor, skjønt prøver tar tre dager for å gjennomgå den kompanalysen, kan data genereres hver dag. Assuming24 chips behandles hver dag, gjør at en fem dagers arbeidsuke i over 1000 DNA-prøver som skal kjøres på en 12-sample perle chip. Hvis noen trinn eller reagens har sviktet, men kan flere partier være i faresonen for dårlig ytelse før en eventuell korreksjon kan brukes. Feil kan unnslippe varsel før arrays skannes eller analyseres, og derfor hvis gjennomstrømning er maksimert, hundrevis av prøver i ulike stadier av protokollen kanskje allerede har fått den samme defekte behandling etter oppdagelsen. Som tapte reagenser og data ikke kan gjenopprettes, må brukeren veie disse risikoene mot behovet for en akselerert arbeidsflyt.
Den GenomeStudio analyse programvare er den første sjansen til å virkelig måle suksessen av genotyping prosessen. Hvis Norm-R vs Norm-Theta intensitet tomter er riktig gruppert, bør den gjennomsnittlige samtalehastighet (prosent av total SNPs hell skrevet) av prøvene nærmer 99%, selv om denne verdien varierer SLIghtly avhengig rekke type. Dataene fra noen prøve med en samtalehastighet lavere enn 85-90% er ikke troverdig og skal kastes. For kvalitetskontroll, bør resultatene bli sammenlignet med noen tidligere kjente genotyper når det er mulig. Hvis ingen slike data foreligger, er tilsiktet prøve duplisering et nyttig verktøy i å verifisere plate eller array-plasseringer. Disse dupliserte parene bør plasseres på separate brikker, plater, partier, eller prosjekter, deres genotyper kontrollert ved generasjon. Mens spesifikke QC begrensninger varierer i henhold til etterforsker preferanser, er vanlige SNP begrensninger basert på utvalgets samtale suksess, Hardy-Weinberg likevekt, eller missingness mellom saker og kontroller, mens vanlige utvalgsbegrensninger er basert på ringeprisene, Mendels uoverensstemmelser, eller kryssreferanser av X-kromosom heterozygosity til kliniske kjønns data [13].
Hvis noen problemer oppstår, Kontroller Dashboard, som finnes i analysen suite, kan foreleggesselskapet for å fastslå årsaken. Disse kontrollene kan ofte begrense problemet til den mest sannsynlige trinn eller reagens svikt. Hvis noen SNPs av interesse er funnet gjennom en infinium genotyping eksperiment, bør deres intensitet tomter være dobbelt-sjekket inn GenomeStudio for clustering feil før videre forskningen er utført.
En mislykket infinium genotyping eksperiment skyldes sannsynligvis menneskelig behandlingsfeil eller dårlig kvalitet innspill DNA. Sample kvantifisering må være nøyaktig og presis. For best resultat, noen reagenser lagt til noen prøve eller chip må fravikes ved volum satt av protokollen. Pipetter må være riktig kalibrert. Reagenser bør ikke løpe etter utløp og skal ikke fryses på nytt tint, lagre for RA1 reagens. For å minimalisere eventuelle flekker og forlengelses feil, må det formamid / EDTA blanding fremstilles frisk hver måned. Alle -20 ° C reagenser skal oppbevares i manuell-avrime frysere bare. Alle labware brukes i staining, bør forlengelse, og vask deler av protokollen skylles grundig med vann og mild såpe umiddelbart ved stillstand. De fuktig reservoarene i hyb kammeret bør vaskes med et reagensrør børste og mildt vaskemiddel. De glassplater bør vaskes med 10% blekemiddel, som instruert av sine brukermanualer, en gang i uken.
The authors have nothing to disclose.
Midler til dette arbeidet har blitt gitt av NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, og NIH R56 AI063274
Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |