Um<em> In-vitro</em> Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto
Summary
Nós demonstramos um protocolo de cultura de células para o estudo directo de componentes neuronais e gliais do sistema nervoso entérico. Um neurônio / glia cultura mista em lamelas é preparado a partir do plexo mioentérico de rato adulto fornecendo a capacidade de examinar neurônio individual e função glia por eletrofisiologia, imuno-histoquímica,<em> Etc</em>.
Abstract
O sistema nervoso entérico é uma vasta rede de neurónios e células da glia a todo o comprimento do tracto gastrointestinal que funcionalmente controla a motilidade gastrointestinal. Um procedimento para o isolamento e cultura de uma população mista de neurónios e células da glia do plexo mientérico é descrito. As culturas primárias podem ser mantida durante mais de 7 dias, sendo as ligações entre os neurónios em desenvolvimento e glia. A tira de músculo longitudinal com o plexo mientérico é anexa separada do músculo circular subjacente do cólon ou do íleo do rato e submetidos a digestão enzimática. Em condições estéreis, a população de neurónios e células gliais isolado são conservados no interior do sedimento após centrifugação e semeadas em lamelas. Dentro de 24-48 horas, neuritos ocorre e os neurónios podem ser identificados por meio de marcadores pan-neuronais. Depois de dois dias em cultura, os neurônios disparam potenciais de ação isolados, como observado por estudos patch clamp. Além disso, a glia entérico também podem ser identifIED, pela coloração GFAP. A rede de neurônios e células gliais em estreita aposição forma dentro de 5-7 dias. Neurónios entéricos podem ser individualmente e directamente estudada usando métodos tais como a imuno-histoquímica, electrofisiologia, imagiologia de cálcio, e PCR de uma única célula. Além disso, este procedimento pode ser realizado em animais geneticamente modificados. Esta metodologia é simples de executar e barato. Em geral, este protocolo apresenta os componentes do sistema nervoso entérico de uma forma facilmente manipulada de modo a que podemos descobrir melhor a funcionalidade do ENS em estados normais e de doença.
Introduction
O sistema nervoso entérico (ENS) é vasta rede de nervos e células da glia, que corre todo o comprimento do tracto gastrointestinal (GI). A ENS funcionalmente controla todos os aspectos da digestão, incluindo o peristaltismo, a absorção / secreção fluida, sensação de estímulos, etc (para revisão ver 1). Contém mais de 500 milhões de neurónios, mais do que o encontrado na medula espinhal, e contém todas as classes neurotransmissor que se encontra no cérebro. Além disso, o ENS é único na medida em que ele pode funcionar por reflexo, sem entrada a partir do sistema nervoso central 2. Compreender do ENS é crucial não apenas para compreender o seu papel fisiológico normal, mas entender seu envolvimento numa variedade de neuropatias, que podem ser congénita (doença de Hirschsprung), adquirida (Chagas), secundário para os estados de doença (gastroparesia diabética), a droga induzida (síndrome do intestino opióides), ou devido a uma lesão (íleo pós-operatório) 1. Além disso, os neurónios entéricos pode ser um reservoir para infecções virais (varicela zóster) 3. Devido às suas semelhanças com o cérebro e os elevados níveis de serotonina no intestino, os medicamentos que visam o tratamento de defeitos do sistema nervoso central, têm frequentemente efeitos secundários indesejáveis sobre o ENS 2. É também de notar que muitas neuropatias tais como a doença de Alzheimer e doença de Parkinson mostra alterações celulares semelhantes nos neurónios entéricos longos antes da sua aparência em neurónios centrais, tornando-o acessível a ENS um modelo para estudar a patogénese destas doenças 4. Portanto, uma compreensão completa do ENS é uma necessidade em compreender os estados de doença e prevenir / prever os efeitos secundários farmacológicos.
Os neurónios do ENS terem sido tradicionalmente estudada em cobaias utilizando preparações Wholemount 5-7 ou culturas de neurónios 8. Apesar da facilidade com que os neurônios podem ser estudados neste grande animal, este modelo tem muitas limitações, incluindofalta de linhagens geneticamente modificadas, a falta de reagentes específicos para a espécie, eo alto custo associado com ordenação e abrigando esses assuntos. O desenvolvimento de um modelo de sistema nervoso entérico murino tem a vantagem única de várias knock out sistemas, uma vasta gama de outras metodologias estabelecidas que podem ser usados em conjunção com a técnica de cultura de células, e a capacidade de fornecer uma validação para o modelo de cobaia .
O SNE é composta por três plexos que correm o comprimento do tracto gastrointestinal: o exterior do plexo mientérico (entre o músculo longitudinal e circular), que é o principal responsável pelas acções peristálticos do intestino, bem como os plexos submucosa e mucosa, ( encontrado em e dentro da mucosa, respectivamente), que controla em grande parte a absorção de fluido / secreção e a detecção de estímulos 1. Este método começa com o isolamento do músculo / plexo mientérico (PMLM) preparação longitudinal por raspagemfora a camada exterior do músculo do tracto GI. Isto reduz drasticamente a contaminação problemas que surgem quando a camada mucosa está envolvida no isolamento. Como um resultado, este processo é ideal para o estudo de controlo neuronal da motilidade em vez de acções secretoras do ENS.
O método aqui apresentado resulta numa cultura mista de neurónios entéricos e glia. Pelo menos dois tipos diferentes de neurónios estão presentes, com base em observações anteriores, electrofisiológicos e imunocitoquímica 9. A presença de células gliais é altamente vantajosa, uma vez que não só são um importante tipo de células a estudar, por direito próprio, mas contribuem para a sobrevivência dos neurónios entéricos 10 e manter a expressão do receptor nativo na superfície de células neuronais 11. Além disso, as deficiências da glia entérico pode levar a doenças gastrointestinais, estados anormais de motilidade, cunhados 12 'neuro-gliopathies'. Portanto, a cultura ENS aqui apresentados resultados em vários tipos de células que estão maduros para a investigação.
As vantagens desta metodologia são a facilidade de isolamento, os requisitos de ferramentas de baixo custo, e um curto espaço de tempo para dominar a técnica por pessoal de laboratório experientes. Limitações da metodologia incluem o baixo rendimento das células em geral a partir de volumes elevados de tecido ea exclusão de ENS neurônios de plexi da mucosa e submucosa. Este procedimento será altamente vantajosa para os estudiosos especializados em eletrofisiologia, imuno-histoquímica, PCR de uma única célula, e outras metodologias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Animais usados
Este protocolo foi otimizado para camundongos Swiss Webster. No entanto, este método é facilmente adaptável a outros mamíferos de pequeno porte, tais como ratos, e outras estirpes de ratinhos. Temos realizado com sucesso isolamentos preliminares com C57 e receptores μ-opióide knock-outs. No entanto, também é possível que outras estirpes de ratinhos pode ser problemática devido às variações morfológicas no tracto GI. Além disso, existem diferenças entre as estirpes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Instituto Nacional de Saúde Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Materials
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
Referências
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