En guidet materialet screening tilnærming for å utvikle sol-gel avledet protein dopet mikromatriser med en ny pin-utskrift metode for fabrikasjon er beskrevet. Denne metodikken er demonstrert gjennom utvikling av acetylkolinesterase og multikinase mikromatriser, som brukes for kostnadseffektiv små-molekyl screening.
Mikromatriser har funnet bruk i utviklingen av high-throughput analyser for nye materialer og oppdagelse av små-molekyl narkotika fører. Heri beskriver vi en guidet materiale screening tilnærming for å identifisere sol-gel baserte materialer som er egnet for produksjon av tredimensjonale protein mikromatriser. Tilnærmingen identifiserer første materialer som kan skrives som mikromatriser, smalner ned antall materialer ved å identifisere de som er forenlig med et bestemt enzym analysen, og deretter hones inn på optimale materialer basert på oppbevaring av maksimal enzymaktivitet. Dette blir anvendt for å utvikle mikromatriser egnet for to forskjellige enzymanalyser, en ved hjelp av acetylcholinesterase og den andre ved hjelp av et sett med fire viktige kinaser som er involvert i kreft. I hvert tilfelle var det mulig å produsere mikromatriser som kunne brukes for kvantitativ små-molekyl screening-analyser og produksjon av doseavhengige inhibitor responskurver. Viktigere, muligheten til å skjerme mange kompisrials produsert informasjon om hvilke typer materialer som passer best både microarray produksjon og oppbevaring av enzymaktivitet. Materialet data gir innsikt i grunnleggende materielle krav som er nødvendige for å skreddersy optimale, høy tetthet sol-gel avledet mikromatriser.
Mikromatriser har vunnet popularitet i det vitenskapelige samfunn som en metode for å øke analysen gjennomstrømming. Siden utviklingen av microarray teknologi for å vurdere genuttrykk 1 på midten av 1990-tallet har mikromatriser funnet bruk i utviklingen av high-throughput analyser for å identifisere protein-protein-og protein-lite molekyl interaksjoner, og å finne nye materialer med unike egenskaper. 2-5 Mer nylig har mikromatriser blitt utviklet hvori spesifikke materialer benyttes for å immobilisere funksjonelle proteiner, produsere en tredimensjonal mikroarray element innenfor hvilke proteiner som er fanget, noe som muliggjør lettvint måling av enzymatisk aktivitet, og inhibering på mikroarray seg selv ved hjelp av en passende fluorescens analysen som er koblet til underlaget omsetning. 5-10 Viktigere, kan slike mikromatriser være utformet for å omfatte alle nødvendige komponenter til skjermen prøver og kontroller sammen i en svært parallell måte. 5,8 </ P>
Tidlige eksempler på protein mikromatriser ble vanligvis fremstilt ved hjelp av standardmetoder for protein immobilisering på faste bærere, slik som kovalent tilknytning, 11 affinitet fange 3 og fysikalsk adsorpsjon. 12. Selv om disse metoder for bio-immobilisering tillate økt prøven konsentrasjon og akselerert reaksjonskinetikk kreves for analysen miniatyrisering, de hver lider ulemper. Generelt er alle føre til en reduksjon i native biomolekyl funksjonalitet på grunn av kjemisk modifisering av overflaten, hindres adgang til aktive seter, eller uriktig orientering på grunn av ikke-spesifikk immobilisering. Dermed har alle disse metoder gir lavere assay følsomhet til tross for en økning i biomolekyl avsetning, en reaksjon som sannsynligvis oppstår på grunn av behovet for å kunstig binde biomolekyler til en overflate.
En voksende tilnærming for produksjon av funksjonelle biomolekyl mikromatriser er gjennom pin-utskrift av protein-dopetsilikasoler bort på fast underlag, som er typisk enten funksjonaliseres glassplater eller individuelle brønner i mikrobrønnplater. Den sol-gel-prosessen i seg selv finner sted i et vandig miljø ved romtemperatur, og det er den flytende forløper som er trykt og deretter geler som kunne fange biomolekyler i 3D-matrise, slik at for høy protein lasting 13 samt innlagring av flere komponenter innenfor den samme mikroarray element. 13,14 Tilpasning av sol-gel avledet materiale kan gjøres gjennom nøye utvalg av forskjellige silika-forløpere, samt ved å endre den vandige komponenten gjennom bruk av forskjellige buffere (pH, ionestyrke) og inkludering av forskjellige additiver (polymerer, små molekyler) til å oppnå et optimalt materiale, avhenger den spesifikke arten av dette på biomolekyl som er innfanget. 10.
En potensiell begrensning forbundet med å utvikle sol-gel avledet protein mikromatriser via pin-utskrift erbehovet for å identifisere sol-gel komposittmaterialer som kan skrives ut uten herding i pin eller viser uønskede egenskaper (uforklarlige spot størrelser, sprekker, dårlig vedheft, inkompatibilitet med Analysekomponentene, dårlig protein aktivitet) når trykket på en overflate. fem Samtidig optimalisering av alle disse parametrene utelukker en tilnærming hvori materialene kan utformes de novo, eller undersøkt langsomt i en seriell måte. På den annen side, er tilfeldig screening av flere tusen eller titusener av materialer hverken tid-nor kostnadseffektiv.
I denne artikkelen beskriver vi en rettet screening-metode som tillater hurtig identifisering av egnede materialer for fremstilling av protein mikromatriser uten behov for å tilfeldig screene et stort antall materialer. Ved hjelp av en guidet tilnærming, er materialer som egner seg for microarray utskrift først identifisert, etterfulgt av en rekke småskala skjermer for å identifisere optimal sol-gel avledet materialeral-kombinasjoner som kan skrives på reproduserbar måte, uten å sprekke, og er forenlig med et bestemt assay. Endelig er optimale materialer identifisert basert på retensjon av enzymaktivitet og ytelse i en endelig liten molekyl-screening-analyse. På denne måten, kan optimale materialer bli identifisert fra mange tusen kandidater ved hjelp av bare noen få hundre assay-fremgangsmåten. Vi demonstrerer denne tilnærmingen for fabrikasjon av både høy tetthet og acetylcholinesterase multikinase mikromatriser, og bruken av slike mikromatriser for små-molekyl-screening.
Den metodikk som beskrives her ble valgt som den mest passende for å identifisere utskrivbare sol-gel avledet materiale med en kontakt skriver, som produserer en tids-og kostnadseffektiv fremgangsmåte for rask identifisering av optimale materialer uten å screene et stort antall materialer. Fra et totalt ~ 20.000 mulige materialer, var det mulig å identifisere ~ 200 materialer som var egnet til trykking på grunnlag av geldannelsen tid alene. Dette betydelig redusert antall materialer som trengs for å være forberedt for senere utskrift prøvelser. Disse utskrivbare materiale ble deretter skrevet ut fire glideflatene for totalt 768 material-skli kombinasjoner. I gjennomsnitt kan 50 flekker / gjentak av ett materiale skrives ut i ~ 3 min, inkludert sample lasting, spot avsetning og pin rengjøring. Av disse 155 materialer, eller omtrent 20%, lov til å skrive ut det maksimale antall plasser pr løsning opptak og produsert reproduserbare spot størrelser. Det bør bemerkes at av de fire slide overflater testet, materialer trykt bedre i rekkefølge: amin> epoxy> aldehyd> PMMA; PMMA lysbilder ikke produsere nyttige arrays for noen materialer. Dette var sannsynligvis tilskrives polariteten av overflatebelegget. Sammenligning av de nevnte glideflatene, ble den mer polare amin og epoksy er bedre egnet for de vandige solene sammenlignet med PMMA lysbilder. Videre, av de testede flater, aminet belagte objektglass som et mulig positivt ladet overflate for det avsatte anionisk sol til bindingen. Vi mistenker, nanopartiklene silika i grenseflaten mellom lysbilde og sol samhandle langs overflaten. Både epoxy og aldehyd glideflatene mangler den samme innledende kostnad-basert samhandling. For å sikre optimal sted deponering er det sterkt anbefalt å bruke forbelagte lysbilder fra en leverandør som Arrayit. In-house belegg gir inkonsistente overflater som fører til dårlig sted reproduserbarhet 13, og i noen tilfeller kan føre til kvantifisering probblemer. 18. Av like stor betydning, temperatur og fuktighet påvirker "trykkbarhet" av materialet. Selv om ingen detaljerte studier på effekter relatert til temperatur ble utført, ble utskrift alltid utført ved romtemperatur (23 ± 3 ° C). Fuktighet (større enn 80%) ble også kontrolleres innen print kammeret for å forhindre uregelmessig form avleiring på grunn av små mengder (0,7 til 2,3 deponering nl) og fordamping.
Mens materialet skjermen ble guidet mot å identifisere optimale sol-gel avledet materialer spesielt for trykking av verke og kinaser, et lite sett med materialer ble identifisert som jobbet for begge typer proteiner. Faktisk ble begge de materialene som ble identifisert for kinase microarray fabrikasjon basert på SS + PVA + glyserol, og både materialer ble også identifisert i løpet av de 26 materialene som er valgt for AChE mikromatriser. Disse "optimale" materialer kan tilby et generisk utgangspunkt for å utvikle videre protei-dopet sol-gel baserte mikromatriser og små skjermer sentrert rundt disse preparatene kan identifisere enda bedre materialer for microarray fabrikasjon. Et annet punkt å merke seg er betydningen av det anvendte enzym. I tilfelle av AChE (en heller robust enzym), beholdt 26 (eller omkring 40%) av de opprinnelige 66 materiale identifisert som assay-kompatibel aktiviteten av innesluttet AChE. Imidlertid, for de mer delikate kinaser, var bare 2 av de 69 assay-kompatible sammensetninger, eller omtrent 3% til materialet, i stand til å beholde aktiviteten av alle kinaser. Selv om et tilstrekkelig antall forskjellige enzymer ikke har blitt studert for å gjøre konkluderende påstander, synes det som om optimalisering matrise fabrikasjon med forholdsvis ustabile enzymer kan føre til identifikasjon av materialer som kan innfange et bredt utvalg av proteiner for å tillate mutliplexed mikromatrise fabrikasjon.
Uavhengig av det valgte proteinet, var det store cut-off faktor for identifisering trykkbare materialer behovet for en langmaterielle geling ganger (> 2,5 t). Ved utvikling SS sol-gel baserte materialer, er det meget viktig å sikre at etter ionebytting og filtrering, er den sol ved omtrent pH 4.. Soler med en lavere initiell pH kan resultere i materialer med en lavere-enn-nøytral pH, noe som kan påvirke enzymaktivitet. 19. Justere mengden Dowex (ionebytterharpiks) til SS kan forandre endelig pH av sol. Når en ny batch av harpiksen er fremstilles forholdet mellom harpiks til SS må justeres slik at det dannes soler ved omtrent pH 4 ved å følge prosedyren i del 2 av protokollen.
Likeledes er fremstillingen av krystallinske DGS ofte en kilde til feil i forbindelse med materiale svikt ved bruk av DGS baserte soler for innestengning biomolekyl. Selv om det ikke er rapportert her i detalj, må stor forsiktighet for å bli tatt i løpet av syntesen av krystallinske DGS, særlig behovet for å unngå tilstedeværelse av vann i løpet av syntesen, som kan produsere polyglycerated silikates heller enn monomere DGS. Også på grunn av den hygroskopiske natur av DGS, trenger den krystallinske prøve som skal lagres og uttørrede brukt i løpet av 6 måneder etter syntese. Krystallinske DGS eldre enn 6 måneder kan ikke løses fullt ut (på grunn av delvis kondensert Polyglyceryl silikat materiale) selv med lydbehandling i et surt miljø. Ufullstendig DGS oppløsning produserer solene med ukjente og ukontrollerbare silica innhold og dermed mindre robuste materialer.
Et viktig poeng å merke seg med kontakt utskriften er kvaliteten på pinnene. Skadet eller mishandlet pins (figur 9) vil aldri gi reproduserbare arrays uavhengig av materialet som skrives ut. Det anbefales å sjekke pin kvalitet ved hjelp av en disseksjon mikroskop for å sikre ødelagt eller tett pins brukes ikke. Forsiktig håndtering sikrer lang levetid for pinnene. Fri bevegelse av tappen er også viktig. I tilfeller der fuktighet blir fanget i skrivehodet mellom hodet og pinnen, pinnenvil ikke plass på riktig måte og således vil ikke gjøre god kontakt med overflaten, noe som resulterer i en mangel på avleiring av materiale.
I konklusjonen, har vi gitt en detaljert, flertrinns screening tilnærming for å utvikle high-density protein dopet pin-trykte mikromatriser. Denne screening omfatter optimalisering av materialegenskapene (geldannelsen tid og trykkbarhet) for å tillate trykking av materialer, fulgt av mer fokusert screening for å identifisere materialer som er forenlig med et bestemt assay og i stand til å beholde enzymaktivitet. Dette guidet materialet screening tilnærming kan brukes til flere microarray formater for å redusere tid og kostnader forbundet med å produsere effektive høy tetthet mikromatriser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Lille, Xin Ge og Laura Lautens for å få hjelp i utvikling av protein mikromatriser. Forfatterne også takke Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) for å finansiere dette arbeidet. Forfatterne også takke Canada Foundation for innovasjon og Ontario Innovation Trust for støtte i dette arbeidet. JDB holder Canada Research Chair i Bioanalytical kjemi og Biointerfaces.
Reagent/Material | |||
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Alderich | 360627 | 80% hydrolozyed, Mw 600 |
Polyethylene glycol 600 (PEG) | Sigma-Alderich | 87333 | |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Alderich | 482595 | 50% (w/w) solution in water |
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) | Gelest, Inc. | SIC2263.0 | 25% in water |
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) | Gelest, Inc. | SIT8189.0 | 50% in ethanol |
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) | Gelest, Inc. | SIB1660.0 | |
Methyltrimethoxysilane (MTMS) | Gelest, Inc. | SIM6560.1 | |
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) | Gelest, Inc. | SIB1817.0 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Gelest, Inc. | SIA0610.0 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | 49767 | |
D-Sorbitol | Sigma-Alderich | 240850 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Alderich | T9531 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | X-100 | |
Nε-Acetyl-L-lysine | Sigma-Alderich | A4021 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Alderich | 154563 | |
HEPES | Sigma-Alderich | H3375 | |
Sodium hydroxide, 1.0 N | LabChem Inc. | LC24350-2 | |
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N | LabChem Inc. | LC15300-2/LC152220-2 | |
Magnesium chloride | Sigma-Alderich | M8266 | |
Diglycerolsilane (DGS) | Prepared in laboratory | ||
Sodium silicate solution | Fisher Scientific | SS338-1 | |
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin | Sigma-Alderich | 217492 | |
Acetylthiocholine iodide | Sigma-Alderich | 1480 | |
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) | Sigma-Alderich | C2888 | |
BODIPY FL L-Cystine | Invitrogen | B-20340 | |
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit | Invitrogen | P33706 | |
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution | Sigma-Alderich | A6559 | |
MAP Kinase 2 (MAPK2) | EMD Millipore | 454850 | |
p38α/SAPK2a (T106M), active | EMD Millipore | 14-687M | |
Epidermal growth factor (EGFR) | EMD Millipore | Donated by Millipore | |
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) | EMD Millipore | 14-306 | |
Myelin basic protein (MBP) | EMD Millipore | Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore | |
GSM | EMD Millipore | 12-533 | Substrate for GSK-3β |
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) | EMD Millipore | 12-440 | Substrate for EGFR |
Stealth pin | ArrayIt | SMP3 | |
Stealth pin | ArrayIt | SMP7 | |
Amine coated slides | ArrayIt | SMM2 | |
Aldehyde coated slides | ArrayIt | SMA2 | |
Exposy coated slides | ArrayIt | SME2 | |
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides | Exakt Technologies Inc. | 41500 | |
0.2-μm syringe filter | PALL Life Sciences | 4612 | |
Equipment | |||
Virtek Contact Printer | BioRad | ||
Novaray Fluorescence Slide Imager | Alpha Innotech Corporation | ||
Desktop microarray centrifuge | ArrayIt | MHC110V | |
MilliQ Synthesis A10 | Millipore | Used to filter all water required for experiments |