En guidad material screening metod för att utveckla sol-gel härledda protein dopade mikromatriser med en framväxande pin-utskrift tillverkningsmetod beskrivs. Denna metod demonstreras genom utveckling av acetylkolinesteras och multikinashämmare microarrays, som används för kostnadseffektiv små molekyler screening.
Microarrays har funnit användning i utvecklingen av high-throughput analyser för nya material och upptäckt av små-molekyldrogkandidater leads. Häri beskriver vi en guidad tillvägagångssätt material screening för att identifiera sol-gel-baserade material som är lämpliga för framställning av tredimensionella protein microarrays. Tillvägagångssättet identifierar först material som kan skrivas som microarrays, smalnar ner antalet material genom att identifiera de som är kompatibla med en viss enzymanalys, och sedan hones i den optimala material baserade på bibehållande av maximal enzymaktivitet. Detta tillämpas för att utveckla microarrays lämpliga för två olika enzymanalyser, en som använder acetylkolinesteras och den andra med en uppsättning av fyra viktiga kinaser är involverade i cancer. I varje fall var det möjligt att tillverka mikroarrayer som kan användas för kvantitativa små molekyler screeninganalyser och produktion av dosberoende kurvor hämmare svar. Viktigt är, förmågan att screena många matematerial produceras information om de typer av material som är bäst lämpade för både microarray produktion och bevarande av enzymaktivitet. De material data ger insikt i grundläggande materiella krav som är nödvändiga för att skräddarsy optimala, high-density sol-gel härledda mikromatriser.
Microarrays har vunnit popularitet inom det vetenskapliga samfundet som en metod för att öka analys genomströmning. Eftersom utvecklingen av microarrayteknologi att bedöma genuttryck 1 i mitten av 1990-talet, har mikromatriser funnit användning i utvecklingen av high-throughput analyser för att identifiera protein-protein och protein-interaktionen mellan små molekyler, samt att finna nya material med unika egenskaper. 2-5 På senare tid har mikromatriser utvecklats vari specifika material används för att immobilisera funktionella proteiner, som producerar ett tredimensionellt microarray element i vilka proteiner är infångade, vilket möjliggör enkel mätning av enzymatisk aktivitet och hämning på microarray själv användning av en lämplig fluorescens analys som är kopplad till substrat omsättningen. 5-10 Viktigt kan sådana mikromatriser utformas för att inkludera alla nödvändiga komponenter för att screena prover och kontroller tillsammans i en mycket parallellt mode. 5,8 </ P>
Tidiga exempel på protein microarrays typiskt framställdes med användning av standardmetoder för proteinimmobilisering på fasta bärare, såsom kovalent bindning, 11 affinitet fånga 3 och fysikalisk adsorption. 12 Även om dessa metoder för bio-immobilisering möjliggöra ökad provkoncentration och påskyndade reaktionskinetik som krävs för assay miniatyrisering, de var lida nackdelar. I allmänhet, alla orsaka en minskning av infödda biomolekyler funktionalitet grund kemisk modifiering av ytan, hindrad tillgång till aktiva platser, eller felaktig orientering på grund av icke-specifik immobilisering. Således, alla metoder resulterar i lägre analyskänslighet trots en ökning av biomolekyler nedfall, ett svar som sannolikt uppstår på grund av behovet att artificiellt binda biomolekyler till en yta.
En framväxande tillvägagångssätt för produktion av funktionella biomolekyl mikromatriser är genom stift-tryckning av protein-dopadkiseldioxidsoler på fasta bärare, som är typiskt antingen funktionaliserade glasskivor eller individuella brunnar i mikrobrunnplattor plattor. Sol-gel-processen i sig äger rum i en vattenhaltig miljö vid rumstemperatur, och det är det flytande förstadiet som är tryckt och sedan geler att fånga biomolekyler inom 3D-matrisen, vilket möjliggör hög proteinhalt lastning 13 samt inneslutning av multipla komponenter inom samma microarray elementet. 13,14 skräddarsy den härledda sol-gel-materialet kan ske genom noggrant urval av olika kiseldioxid prekursorer, samt genom att förändra den vattenbaserade komponenten genom användning av olika buffertar (pH, jonstyrka), och införandet av olika tillsatser (polymerer, små molekyler) för att uppnå ett optimalt material, beror den specifika karaktär som på biomolekyler som är anhållna. 10
En potentiell begränsning i samband med utvecklingen av sol-gel härledda protein microarrays via pin-utskrift ärbehovet av att identifiera sol-gel kompositmaterial som kan skrivas utan gel i stiftet eller visar oönskade egenskaper (reproducerbara plats storlekar, sprickor, dålig vidhäftning, oförenlighet med analyskomponenter, dålig protein aktivitet) en gång tryckt på en yta. 5 Samtidig optimering av alla dessa parametrar utesluter ett tillvägagångssätt vari material kan utformas de novo, eller undersökta långsamt på ett seriellt sätt. Å andra sidan, är slumpmässig screening av många tusen eller tiotusentals material varken tids-eller kostnadseffektivt.
I den här artikeln beskriver vi en riktad screening som möjliggör snabb identifiering av lämpliga material för produktion av protein microarrays utan att behöva slumpmässigt screena ett stort antal material. Med hjälp av en guidad tillvägagångssätt används material lämpliga för microarray utskrift först identifierades, följt av en serie av småskaliga skärmar för att identifiera optimal sol-gel-härlett materialal kombinationer som kan skrivas reproducerbart, utan att spricka och är kompatibel med en given analys. Slutligen är optimala material identifieras baserat på retention av enzymaktivitet och prestanda i en final småmolekylär screeningsanalysen. På detta sätt kan optimala material identifieras från många tusen kandidater med hjälp av endast några hundra analysstegen. Vi visar detta tillvägagångssätt för tillverkning av både hög densitet acetylkolinesteras och mikroarrayer multikinashämmare och användningen av sådana mikroarrayer för småmolekylära screening.
Den metod som beskrivs här valdes som den mest lämpade för att identifiera skrivbara sol-gel erhållet material med en kontakt skrivare, som producerar en tid-och kostnadseffektivt förfarande för att snabbt identifiera optimala material utan att screena ett stort antal material. Av totalt ~ 20.000 potentiella material, var det möjligt att identifiera ~ 200 material som var lämpliga för utskrift på grundval av gelningstiden ensam. Detta minskade signifikant antalet material som behövs för att vara förberedd för senare utskrift prövningar. Dessa utskrivbara material sedan tryckt på 4 glidytor för totalt 768 material-slide kombinationer. I genomsnitt kan 50 platser / replikat av ett material tryckas i ~ 3 min, inklusive provladdning, spot nedfall och pin rengöring. Av de 155 ämnen, eller ungefär 20%, tillåten för utskrift det maximala antalet punkter per lösning upptag och producerade reproducerbara spot storlekar. Det bör noteras att av de 4 slide ytor testas, tryckt material bättre i ordning: amin> epoxy> aldehyd> PMMA, PMMA glider inte producera användbara matriser för något material. Detta var troligen hänföras till polariteten hos ytbeläggningen. Jämföra ovannämnda glidytorna, var den mer polära amin och epoxi bättre lämpade för de vattenhaltiga soler jämfört med PMMA diabilder. Dessutom, av de testade ytor, amin belagda bilderna ger en potentiell positivt laddad yta för den avsatta anjoniska sol till förbindelsen. Vi misstänker, nanopartiklar kiseldioxiden vid gränsytan mellan objektglaset och solen interagera längs ytan. Både epoxi och aldehyden ytor glider saknar samma initiala laddningen-baserad interaktion. För att säkerställa optimal plats nedfall är det starkt rekommenderat att använda pre-belagda diabilder från en leverantör som Arrayit. In-house beläggning producerar inkonsekventa ytor som leder till dålig reproducerbarhet fläck 13 och i vissa fall kan leda till kvantifiering probblem. 18 Av lika stor vikt, temperatur och luftfuktighet påverkar "tryckbarhet" av materialen. Även om detaljerade studier av effekterna relaterade till temperatur utfördes, var utskrifter alltid utföras vid rumstemperatur (23 ± 3 ° C). Fuktighet (större än 80%) har också kontrolleras inom tryckets kammaren för att förhindra oregelbunden form nedfall på grund av små nedfall volymer (0,7-2,3 nl) och indunstning.
Medan materialet skärmen styrdes mot att identifiera optimala sol-gel erhållet material speciellt för tryckning av magen och kinaser, en liten uppsättning av material identifierades som arbetade för båda typerna av proteiner. I själva verket var de båda materialen som identifierades för kinas microarray tillverkning baserad på SS + PVA + glycerol, och båda materialen identifierades även inom de 26 material valda för AChE mikromatriser. Dessa "optimala" material kan erbjuda en generisk utgångspunkt för att utveckla ytterligare protein-dopade sol-gel baserad mikroarray och små skärmar centrerade kring dessa kompositioner kan identifiera ännu bättre material för microarray tillverkning. En andra punkt att notera är vikten av det använda enzymet. I fallet med AChE (en ganska robust enzym), behöll 26 (eller ca 40%) av de ursprungliga 66 material som identifieras som analys-kompatibel aktiviteten av innesluten värker. Men för de mer känsliga kinaser, var endast 2 av de 69 assay-kompatibla kompositioner, eller ungefär 3% av de material, kunna behålla aktiviteten hos alla kinaser. Medan tillräckligt många olika enzymer inte har studerats för att göra entydiga uttalanden, verkar det som optimerande array tillverkning med relativt instabila enzymer kan leda till identifiering av material som kan innesluta en mängd olika proteiner för att tillåta mutliplexed microarray tillverkning.
Oberoende av det valda proteinet, var den främsta cut-off faktor för identifiering utskrivbara material behovet av en långmaterial gelbildningstider gånger (> 2,5 h). När man utvecklar SS baserade sol-gel-material, är det mycket viktigt att säkerställa att, efter jonbyte och filtrering, är solen vid ca pH 4. Soler med ett lägre initialt pH kan resultera i material med ett lägre-än-neutralt pH, vilket kan påverka enzymaktiviteten. 19 justering av mängden av Dowex (jonbytarharts) till SS kan förändra det slutliga pH hos solen. När en ny sats av hartset framställs förhållandet harts till SS måste anpassas så att de ger soler vid ca pH 4 enligt förfarandet i avsnitt 2 i protokollet.
Likaså är framställningen av kristallina DGS ofta en källa till fel i samband med materialbrott vid användning DGS soler för biomolekylen infångning. Även om det inte redovisas här i detalj, måste stor försiktighet iakttas under syntesen av kristallina DGS, i synnerhet behovet av att undvika förekomsten av vatten under syntesen, vilket kan producera polyglycerated kiseldioxidtes snarare än monomera DGS. Också, på grund av den hygroskopiska naturen av DGS, måste den kristallina provet som skall förvarades med torkmedel och användas inom 6 månader efter syntes. Kristallina DGS äldre än 6 månader får inte lösas upp helt (på grund av partiellt kondenserat polyglyceryl silikatmaterial) även med sonikering i en sur miljö. Ofullständig DGS upplösning ger soler med okända och okontrollerbara kiseldioxidinnehåll och därmed mindre robust material.
En viktig punkt att notera med kontakt utskrift är kvaliteten på stiften. Skadade eller felaktig hantering stift (figur 9) kommer aldrig att ge reproducerbara arrayer oberoende av det material som skrivs ut. Det rekommenderas att kontrollera pin kvalitet med hjälp av en dissektion mikroskop för att se trasiga eller igensatta stift inte används. Noggrann hantering säkerställer lång livslängd för stiften. Fri rörelse av stiftet är också viktigt. I de fall där fukten är fångad i skrivarhuvudet mellan huvudet och tappen, tappeninte sittplats korrekt och därmed inte gör ordentlig kontakt med ytan, vilket resulterar i en brist på avsättning av material.
Sammanfattningsvis har vi en detaljerad, flerfassilanordning strategi för utvecklingen av high-density protein dopade pin-tryckta mikromatriser. Screeningen omfattar optimering av materialegenskaper (gelningstid och tryckbarhet) för att tillåta tryckning av material, följt av mer fokuserade screening för att identifiera material som är kompatibla med en given analys och kunna behålla enzymaktivitet. Denna guidade material screening metod kan tillämpas på ytterligare microarray format för att minska tid och kostnader förknippade med att producera effektiva hög densitet mikromatriser.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge och Laura Lautens för hjälp i utvecklingen av protein microarrays. Författarna tackar också för naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) för att finansiera detta arbete. Författarna tackar också Canada Foundation for Innovation och Ontario Innovation Trust för att stödja detta arbete. JDB innehar Kanada forskning ordförande i Bioanalytiska kemi och Biointerfaces.
Reagent/Material | |||
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Alderich | 360627 | 80% hydrolozyed, Mw 600 |
Polyethylene glycol 600 (PEG) | Sigma-Alderich | 87333 | |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Alderich | 482595 | 50% (w/w) solution in water |
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) | Gelest, Inc. | SIC2263.0 | 25% in water |
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) | Gelest, Inc. | SIT8189.0 | 50% in ethanol |
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) | Gelest, Inc. | SIB1660.0 | |
Methyltrimethoxysilane (MTMS) | Gelest, Inc. | SIM6560.1 | |
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) | Gelest, Inc. | SIB1817.0 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Gelest, Inc. | SIA0610.0 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | 49767 | |
D-Sorbitol | Sigma-Alderich | 240850 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Alderich | T9531 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | X-100 | |
Nε-Acetyl-L-lysine | Sigma-Alderich | A4021 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Alderich | 154563 | |
HEPES | Sigma-Alderich | H3375 | |
Sodium hydroxide, 1.0 N | LabChem Inc. | LC24350-2 | |
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N | LabChem Inc. | LC15300-2/LC152220-2 | |
Magnesium chloride | Sigma-Alderich | M8266 | |
Diglycerolsilane (DGS) | Prepared in laboratory | ||
Sodium silicate solution | Fisher Scientific | SS338-1 | |
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin | Sigma-Alderich | 217492 | |
Acetylthiocholine iodide | Sigma-Alderich | 1480 | |
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) | Sigma-Alderich | C2888 | |
BODIPY FL L-Cystine | Invitrogen | B-20340 | |
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit | Invitrogen | P33706 | |
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution | Sigma-Alderich | A6559 | |
MAP Kinase 2 (MAPK2) | EMD Millipore | 454850 | |
p38α/SAPK2a (T106M), active | EMD Millipore | 14-687M | |
Epidermal growth factor (EGFR) | EMD Millipore | Donated by Millipore | |
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) | EMD Millipore | 14-306 | |
Myelin basic protein (MBP) | EMD Millipore | Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore | |
GSM | EMD Millipore | 12-533 | Substrate for GSK-3β |
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) | EMD Millipore | 12-440 | Substrate for EGFR |
Stealth pin | ArrayIt | SMP3 | |
Stealth pin | ArrayIt | SMP7 | |
Amine coated slides | ArrayIt | SMM2 | |
Aldehyde coated slides | ArrayIt | SMA2 | |
Exposy coated slides | ArrayIt | SME2 | |
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides | Exakt Technologies Inc. | 41500 | |
0.2-μm syringe filter | PALL Life Sciences | 4612 | |
Equipment | |||
Virtek Contact Printer | BioRad | ||
Novaray Fluorescence Slide Imager | Alpha Innotech Corporation | ||
Desktop microarray centrifuge | ArrayIt | MHC110V | |
MilliQ Synthesis A10 | Millipore | Used to filter all water required for experiments |