대규모 유전자 넉다운에<em> C. 엘레</em> 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용
Summary
dsRNA에는 C.에 공급하면서 엘레 대규모 공급 화면 현재 프로토콜이 변수 최저 효율 결과 유전자 기능을 평가하는 강력한 도구입니다. 우리는 유전자 발현의 높은 효능 및 재현성 넉다운 결과 대규모의 RNAi 수유 화면을 수행하기위한 개선 된 프로토콜을 설명한다.
Abstract
dsRNA에 표현 벌레 박테리아를 먹이로 RNA 간섭 C. 유전자의 기능을 평가하는 유용한 도구이다 엘레. 유전자의 작은 숫자가 최저 대상 때이 전략은 잘 작동하는 동안, 대규모 공급 화면은 자신의 유틸리티를 제한하는 변수 최저 효율을 보여줍니다. 우리는 이전에 출판 된 RNAi의 최저 프로토콜을 해체하고 감소 최저의 기본 소스는 동물에 공급되는 박테리아에서 dsRNA를 코딩하는 플라스미드의 손실에 기인 할 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 관찰을 바탕으로, 우리는 크게 줄이거 나 효율, 높은 처리량 최저를 달성하기 위해 플라스미드 손실을 제거하는 dsRNA에 먹이 프로토콜을 개발했습니다. 우리는이 프로토콜은 C의 아래 강력한 재현 노크를 생산 것을 보여 엘레 신경 등 다양한 조직 유형, 유전자, 그리고 대형 화면에 효율적으로 최저를 허용합니다. 이 프로토콜은 시중에서 dsRNA에 먹이를 사용도서관은 도서관을 복제하고 dsRNA에 화면을 수행하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 프로토콜은 정교한 장비의 사용을 필요로하지 않으며, 따라서 어떠한 C. 의해 수행 될 수있다 실험실 엘레 간스.
Introduction
C. 역사적으로, 유전 화면 엘레 DNA 내에 무작위 돌연변이를 만들 에틸 메탄 술폰산 등의 화학적으로 돌연변이 동물을 처리하여 수행되었다. 돌연변이 동물의 자손 또는 grandprogeny는 그 전시에게 원하는 이상 표현형을 격리됩니다. 표현형의 원인에 대한 책임 돌연변이 후 노동 집약적 매핑 절차를 통해 또는 돌연변이 벌레의 전체 게놈을 시퀀싱에 의해 식별됩니다. 이 그들이 모두 이득 함수 지점 기능 상실 표현형을 초래할 수 웜 게놈 내의 영구 병변을 생성 같은 화학적 돌연변이 스크린을 수행하는 많은 장점이 있지만 매핑 절차가 느리고 비싸다.
이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi)가 중요한 생물 학적 과정에 관련된 유전자를 확인하는 다른 방법을 제공합니다. 이 방법에서, 내생 유전자의 코딩 서열과 일치하는 dsRNA는 웜에 도입된다.dsRNA에이 가이드가 파괴 1을 대상으로 일치하는 내생의 mRNA를 찾아 바인딩하는 역할을 소형 (21 ~ 22 염기) RNA를 생성하기 위해 생체 내에서 처리된다. 이 절차는 비교적 빠른이지만 dsRNA에 오히려보다 DNA의 mRNA를 표적으로하기 때문에, 단지 환원의 기능 표현형이이 방법을 사용하여 관찰된다.
동물에 dsRNA에 도입 dsRNA를 3 동물을 담가, 또는 dsRNA에 4을 표현하는 동물 박테리아를 공급함으로써, dsRNA에 2의 직접 주입에 의해 달성 될 수있다. 동물의 대부분의 세포는 SID-1, dsRNA에 5를 가져올 수있는 횡단 채널을 표현하는 이러한 전달 방법의 각 조직 최저 효과를 일으킬 수 있습니다. 원래시 개별 유전자의 발현을 녹다운하는 역 유전학 방식으로 사용이 급전 라이브러리의 개발은 지금은 대규모 유전자 스크린을 허용한다. 시판하는 dsRNA 라이브러리는 BA를 포함모든 C의 55 % 또는 87 % 중 하나를 나타내는 cterial 클론 elegans의 유전자 6, 7.
불행하게도, 대규모 dsRNAi 공급 화면은 종종 변수 최저 효율 8-10 결과. RNAi에 의한 최저의 절대 레벨이 쉽게 측정되지 않지만, 대형 화면에서 관찰 감소 최저 효율은 RNAi에 의해 열화를 피할 잔류 유전자 특이의 mRNA에 의해 발생되어야한다. 이것은, 차례로, 이러한 화면에 동물에 공급하는 dsRNA 박테리아 플라스미드 손실의 직접적인 결과 일 수있다. 넉다운 효과를 먹인 동물 (11)를 제어하기 위해 비교 될 때 (있는 경우)이 아이디어를지지, 동물은 박테리아의 50 % 만이 표적 유전자의 dsRNA에 대하여을 표현하는, 세균의 혼합물을 공급 극적으로 감소 보여준다. C. 대부분의 유전자로 dsRNAi 화면을 수행 할 때 유전자 최저의 정도는 중요한 문제가됩니다 엘레 haplosufficient이며, 따라서 유전자의 발현은 적어도 50 %의 t에 의해 감소되어야O 기능 상실이 12 표현형의 원인이됩니다.
우리는 대형 스크린을 수행하기 이전에 발행 된 먹이 프로토콜을 사용하고 다른 사람 8-10에서보고 같은 변수 최저의 효과를 발견했다. 가능한 원인에 대한 검색, 우리는 화면에서 동물에 공급되는 박테리아의 약 60 %는 dsRNA에 플라스미드를 잃은 것으로 나타났습니다. 우리는 극적으로 감소 또는 제거 플라스미드 손실을 크게 최저 효율을 향상 도서관 복제 및 검사 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 C.에서 대형 스크린을 수행하기에 적합 엘레하고 시판하는 dsRNA 라이브러리 중 하나 하나를 선별하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 화면 동안 동물에 공급되는 박테리아의 본질적으로 100 % dsRNA에 인코딩 플라스미드를 유지하고 검사를 모든 조직의 기능 표현형의 강력하고 고도로 침투 손실이 발생할 수 있음을 찾을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 C.에 대형 화면을 수행하기 위해 시판하는 dsRNA 수유 라이브러리를 사용하는 프로토콜을 기술했다 엘레. 우리는 라이브러리를 복제하고 효과적으로 사용하는 모든 지침을 제공합니다. 우리는이 방법은 동물의 조직에서 다른 여러 생물학적 과정에 관여하는 유전자를 식별 할 수 있다는 것을 보여준다. 우리가 여기에서 설명하는 표현형 (UNC, EGL, 그리고 DPY) 쉽게 관찰 할 수 있?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 MH097163의 국립 연구소에서 기금에 의해 지원되었다. 일부 균주 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40-OD010440)에 의해 투자 된 CGC에 의해 제공되었다.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
Referências
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