Grootschalige Gene Knockdown in<em> C. elegans</em> Met behulp van dsRNA Feeding bibliotheken Robuuste verlies-van-functie Fenotypes Genereer
Summary
Terwijl dsRNA voeden in C. elegans is een krachtig hulpmiddel om gen-functie, de huidige protocollen voor grootschalige voeden schermen resulteren in variabele knockdown efficiëntie te beoordelen. We beschrijven een verbeterde protocol voor het uitvoeren van grootschalige RNAi voeden schermen die resulteert in een hoogst doeltreffend en reproduceerbare neerhalen van genexpressie.
Abstract
RNA-interferentie door het voeren van wormen bacteriën uitdrukken dsRNAs is een nuttig instrument om gen-functie in C. beoordelen is geweest elegans. Hoewel deze strategie werkt goed wanneer een klein aantal genen zijn gericht op knockdown grootschalige voeden schermen tonen variabele knockdown efficiëntie, waardoor hun bruikbaarheid beperkt. We hebben eerder gepubliceerd RNAi knockdown protocollen ontleed en vonden dat de primaire bron van de verlaagde knockdown kan worden toegeschreven aan het verlies van dsRNA-coderende plasmiden van bacteriën aan de dieren gegeven. Op basis van deze bevindingen hebben we een dsRNA voeden protocol dat sterk vermindert of elimineert plasmide verlies efficiënte, hoge doorvoer knockdown bereiken ontwikkeld. We laten zien dat dit protocol robuust, reproduceerbaar klop zal produceren beneden van C. elegans genen in meerdere soorten weefsel, met inbegrip van neuronen, en zullen efficiënte knock-down in grootschalige schermen mogelijk te maken. Dit protocol maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar dsRNA voedingbibliotheek en beschrijft alle stappen die nodig zijn om de bibliotheek te dupliceren en uit te voeren dsRNA schermen. De protocol niet het gebruik van geavanceerde apparatuur vereisen en derhalve worden uitgevoerd door elke C. elegans lab.
Introduction
Historisch genetische schermen in C. elegans uitgevoerd door behandeling van dieren met een chemisch mutageen zoals ethylmethaansulfonaat van willekeurige mutaties in het DNA te maken. Nageslacht of grandprogeny van gemutageni dieren worden vervolgens geïsoleerd dat vertonen een gewenste abnormale fenotype. De mutatie die verantwoordelijk is voor het veroorzaken van het fenotype wordt vervolgens geïdentificeerd door middel van een arbeidsintensieve mapping procedure of door sequencing van het gehele genoom mutante worm. Er zijn vele voordelen aan het uitvoeren van dergelijke chemische mutagenese schermen die blijvende letsels binnen de worm genoom die kan leiden tot zowel gain-of-functie en verlies-van-functie fenotype te creëren, maar de mapping procedure is langzaam en duur.
Double-stranded RNA interference (dsRNAi) een alternatief middel om genen betrokken bij belangrijke biologische processen te identificeren. Bij deze werkwijze dsRNA overeenkomt met de coderende sequentie van een endogeen gen wordt ingebracht in de worm.Het dsRNA wordt verwerkt in vivo kleine (21-22 nucleotide) RNAs die dienen als leidraad kunnen vinden en binden de bijpassende endogene mRNA's te richten voor vernietiging 1 genereren. Deze procedure is relatief snel, maar omdat dsRNA gericht mRNA plaats van DNA, zijn alleen reductie functieverlies fenotypen waargenomen met behulp van deze benadering.
Introductie van dsRNA in een dier kan worden verkregen door directe injectie van dsRNA 2, door het weken dieren dsRNA 3, of door het voeren van dieren bacteriën die dsRNA 4 drukken. Elk van deze verzendwijzen veroorzaken systemische knockdown effecten meeste cellen van het dier tot expressie SID-1, een transmembraan kanaal kan importeren dsRNA 5. Oorspronkelijk gebruikt als reverse genetics benadering van de expressie van individuele genen een knockdown tegelijk de ontwikkeling van twee voeden bibliotheken maakt nu grootschalige genetische screens. De in de handel verkrijgbare dsRNA bibliotheken bevatten bacterial klonen die hetzij 55% of 87% van C. elegans genen 6, 7.
Helaas, grootschalige dsRNAi voeden schermen vaak resulteren in variabele knockdown efficiëntie 8-10. Hoewel het absolute niveau van knockdown door RNAi is niet gemakkelijk te meten, moet het lagere rendement knockdown waargenomen bij grootschalige schermen worden veroorzaakt door resterende gen-specifieke mRNA dat degradatie te ontsnappen door RNAi. Dit zou op zijn beurt een direct gevolg van dsRNA plasmide verlies van bacteriën toediening aan dieren in deze schermen. Ondersteuning van dit idee, dieren die mengsels van bacteriën, waarbij slechts 50% van de bacteriën tot expressie dsRNA tegen een gerichte gen vertonen drastisch verminderd (indien aanwezig) knockdown effecten vergeleken met gevoede dieren 11 besturen. De mate van gen knockdown wordt een zorgpunt bij het uitvoeren dsRNAi schermen zoals de meeste genen in C. elegans zijn haplosufficient en dus genexpressie worden verminderd met ten minste 50% to leiden tot verlies-van-functie fenotypen 12.
We hebben eerder gepubliceerd voeding protocollen die worden gebruikt om grootschalige schermen voeren en vond dezelfde variabele knock-down effecten gemeld door anderen 8-10. In een zoektocht naar mogelijke oorzaken, vonden we dat bijna 60% van de bacteriën gevoed aan dieren in het scherm de dsRNA plasmide verloren had. We hebben een bibliotheek duplicatie en screening protocol dat drastisch vermindert of elimineert plasmide verlies en sterk verbetert knockdown efficiëntie ontwikkeld. Dit protocol is geschikt voor het uitvoeren van grootschalige schermen C. elegans en kan worden gebruikt om ofwel een van de commercieel beschikbare dsRNA screenen. Met dit protocol, vinden we dat in wezen 100% van de bacteriën toediening aan dieren tijdens het scherm steeds de dsRNA-coderend plasmide en veroorzaken robuust en zeer penetrant functieverlies fenotypen in alle onderzochte weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een protocol dat een commercieel verkrijgbare dsRNA voeden bibliotheek gebruikt om grootschalige schermen presteren in C. beschreven elegans. Wij bieden alle opdrachten aan de bibliotheek te reproduceren en om effectief te gebruiken. We tonen aan dat deze benadering kan genen betrokken bij verschillende biologische processen in verschillende weefsels van het dier te identificeren. Terwijl de fenotypes we hier beschrijven zijn gemakkelijk waarneembaar (Unc, EGL en DPY), kan dit protocol worden…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door fondsen van de National Institutes of Health MH097163. Sommige stammen werden verstrekt door de CGC, dat wordt gefinancierd door de NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40-OD010440).
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
Referências
- Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
- Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
- Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
- Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
- Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
- Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genética. 165 (4), 1805-1822 (2003).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
- Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
- Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genética. 172 (4), 2253-2267 (2006).
- Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
- Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
- Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
- Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
- Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
- Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).
