बड़े पैमाने पर जीन पछाड़ना में<em> सी. एलिगेंस</em> मजबूत घाटे का समारोह phenotypes उत्पन्न करने के लिए dsRNA दूध पिलाने पुस्तकालयों का उपयोग
Summary
DsRNA सी. में खिला एलिगेंस बड़े पैमाने पर खिला स्क्रीन के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल चर पछाड़ना क्षमता में परिणाम जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. हम जीन अभिव्यक्ति की अत्यधिक प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पछाड़ना में यह परिणाम है कि बड़े पैमाने पर आरएनएआई खिला स्क्रीन प्रदर्शन के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
DsRNAs व्यक्त कीड़े बैक्टीरिया खिलाने से शाही सेना के हस्तक्षेप सी में जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण किया गया है एलिगेंस. जीन की एक छोटी संख्या पछाड़ना के लिए लक्षित कर रहे हैं जब यह रणनीति अच्छी तरह से काम करता है, बड़े पैमाने पर खिला स्क्रीन उनकी उपयोगिता की सीमा है, जो चर पछाड़ना क्षमता दिखा. हम पहले प्रकाशित आरएनएआई पछाड़ना प्रोटोकॉल deconstructed और कम पछाड़ना का प्राथमिक स्रोत जानवरों को खिलाया बैक्टीरिया से dsRNA एन्कोडिंग plasmids के नुकसान के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि मिल गया है. इन टिप्पणियों के आधार पर, हम बहुत कम कर देता है या कुशल, उच्च throughput पछाड़ना प्राप्त करने के लिए प्लाज्मिड नुकसान समाप्त कि एक dsRNA खिला प्रोटोकॉल विकसित किया है. हम इस प्रोटोकॉल सी. के नीचे मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दस्तक उत्पादन होगा दिखाना है कि एलिगेंस न्यूरॉन्स सहित कई प्रकार के ऊतकों में जीन, और बड़े पैमाने पर स्क्रीन में कुशल पछाड़ना की अनुमति होगी. इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dsRNA खिलाने का उपयोग करता हैपुस्तकालय और पुस्तकालय नकली और dsRNA स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक सभी कदम का वर्णन है. प्रोटोकॉल किसी भी अत्याधुनिक उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है, और इसलिए किसी भी सी. द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है प्रयोगशाला एलिगेंस.
Introduction
सी. में ऐतिहासिक, आनुवंशिक स्क्रीन एलिगेंस डीएनए के भीतर यादृच्छिक म्यूटेशनों बनाने के लिए इस तरह की एथिल methanesulfonate के रूप में एक रासायनिक उत्परिवर्तजन के साथ पशुओं के उपचार के द्वारा प्रदर्शन किया गया है. Mutagenized जानवरों की संतान या grandprogeny तो है कि निशंक एक वांछित असामान्य फेनोटाइप अलग कर रहे हैं. phenotype के कारण के लिए जिम्मेदार उत्परिवर्तन तो एक श्रम प्रधान मानचित्रण प्रक्रिया के माध्यम से या उत्परिवर्ती कीड़ा के पूरे जीनोम अनुक्रमण द्वारा की पहचान की है. वहाँ वे दोनों लाभ समारोह का और नुकसान के समारोह phenotypes में परिणाम कर सकते हैं कि कीड़ा जीनोम के भीतर स्थायी घावों बनाने के रूप में इस तरह के रासायनिक mutagenesis स्क्रीन प्रदर्शन करने के कई फायदे हैं, लेकिन मानचित्रण प्रक्रिया धीमी और महंगी है.
डबल असहाय शाही सेना हस्तक्षेप (dsRNAi) महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में शामिल जीनों की पहचान करने के लिए एक वैकल्पिक साधन उपलब्ध कराता है. इस विधि में, एक अंतर्जात जीन की कोडिंग अनुक्रम मिलान dsRNA कीड़ा में शुरू की है.dsRNA गाइड विनाश 1 के लिए उन्हें निशाना बनाते मिलान अंतर्जात mRNAs लगता है और बाध्य करने के लिए के रूप में सेवा है कि छोटे (21-22 न्यूक्लियोटाइड) RNAs उत्पन्न करने के लिए vivo में कार्रवाई की है. यह प्रक्रिया अपेक्षाकृत जल्दी है, लेकिन dsRNA बल्कि डीएनए से mRNA लक्ष्य है, क्योंकि केवल कमी के समारोह phenotypes इस दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं मनाया.
एक जानवर में dsRNAs का परिचय dsRNA 3 में जानवरों भिगोने से, या dsRNA 4 व्यक्त जानवरों है कि बैक्टीरिया भोजन करके, dsRNA 2 के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. पशु की सबसे कोशिकाओं सिड -1, dsRNA 5 आयात करने में सक्षम एक transmembrane चैनल व्यक्त के रूप में इन प्रसव के तरीके में से प्रत्येक प्रणालीगत पछाड़ना प्रभाव के कारण. मूल रूप से एक समय में व्यक्तिगत जीनों की अभिव्यक्ति एक पछाड़ना के लिए एक रिवर्स आनुवंशिकी दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया, दो खिला पुस्तकालयों का विकास अब बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन परमिट. वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध dsRNA पुस्तकालयों बीए होतेसभी सी. के 55% या 87% या तो का प्रतिनिधित्व cterial क्लोन एलिगेंस जीन 6, 7.
दुर्भाग्य से, बड़े पैमाने dsRNAi खिला स्क्रीन अक्सर चर पछाड़ना क्षमता 8-10 में परिणाम. आरएनएआई द्वारा पछाड़ना की पूर्ण स्तर आसानी से मापा नहीं है, वहीं बड़े पैमाने पर स्क्रीन में मनाया कम पछाड़ना दक्षता आरएनएआई द्वारा गिरावट से बच कि अवशिष्ट जीन विशिष्ट mRNAs की वजह से किया जाना चाहिए. यह, बारी में, इन स्क्रीन में पशुओं को खिलाया बैक्टीरिया से dsRNA प्लाज्मिड घटाने का एक सीधा परिणाम हो सकता है. पछाड़ना प्रभाव फेड जानवरों 11 को नियंत्रित करने के लिए जब तुलना में (यदि हो तो) इस विचार का समर्थन, जानवरों बैक्टीरिया का केवल 50% एक लक्षित जीन के खिलाफ dsRNAs व्यक्त जिसमें, बैक्टीरिया का मिश्रण खिलाया, नाटकीय रूप से कम दिखा. सी. में सबसे जीन के रूप में dsRNAi स्क्रीन प्रदर्शन जब जीन पछाड़ना की हद तक एक गंभीर चिंता का विषय बन जाता है एलिगेंस haplosufficient हैं और इस तरह के जीन की अभिव्यक्ति में कम से कम 50% टी से कम किया जाना चाहिएओ घाटे का समारोह 12 phenotypes कारण.
हम बड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए पहले से प्रकाशित खिला प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया और दूसरों 8-10 द्वारा रिपोर्ट एक ही चर पछाड़ना प्रभाव पाया गया है. संभावित कारणों के लिए एक खोज में, हम स्क्रीन में पशुओं को खिलाया बैक्टीरिया का लगभग 60% dsRNA प्लाज्मिड खो दिया था पाया. हम नाटकीय रूप से कम कर देता है या समाप्त प्लाज्मिड नुकसान और बहुत पछाड़ना दक्षता में सुधार एक पुस्तकालय दोहराव और स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल विकसित किया है. इस प्रोटोकॉल सी. में बड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन के लिए उपयुक्त है एलिगेंस और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dsRNA पुस्तकालयों में से एक या तो स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम स्क्रीन के दौरान पशुओं को खिलाया बैक्टीरिया का अनिवार्य रूप से 100% dsRNA एन्कोडिंग प्लाज्मिड बनाए रखने और जांच की सभी ऊतकों में समारोह phenotypes की मजबूत और अत्यधिक व्याप्ति के झड़ने का कारण हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सी. में बड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dsRNA खिला पुस्तकालय का उपयोग करता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है एलिगेंस. हम पुस्तकालय नकल करने के लिए और प्रभ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य MH097163 के राष्ट्रीय संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित किया गया. कुछ उपभेदों रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर कार्यक्रम के एनआईएच कार्यालय (P40-OD010440) द्वारा वित्त पोषित है जो CGC, द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
Referências
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