Em larga escala Knockdown Gene em<em> C. elegans</em> Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função
Summary
Enquanto dsRNA alimentação em C. elegans é uma ferramenta poderosa para avaliar a função do gene, os protocolos atuais para telas de alimentação em grande escala resultar em eficiências knockdown variáveis. Descreve-se um protocolo melhorado para a realização em grande escala de RNAi telas de alimentação, que resulta em knockdown altamente eficaz e reprodutível de expressão do gene.
Abstract
RNA de interferência, alimentando vermes bactérias expressando dsRNAs tem sido uma ferramenta útil para avaliar a função do gene em C. elegans. Embora esta estratégia funciona bem quando um pequeno número de genes são direcionados para knockdown, telas de alimentação de grande porte mostram eficiência knockdown variáveis, o que limita sua utilidade. Temos Desconstruído protocolos knockdown RNAi publicados anteriormente e descobriram que a fonte primária do knockdown reduzida pode ser atribuída à perda de plasmídeos que codificam dsRNA das bactérias alimentadas aos animais. Com base nessas observações, temos desenvolvido um protocolo de alimentação dsRNA que reduz muito ou elimina a perda de plasmídeo para alcançar eficiente e de alta taxa de transferência knockdown. Demonstramos que este protocolo irá produzir robusto, batida reprodutível para baixo de C. elegans genes em vários tipos de tecidos, inclusive neurônios, e permitirá knockdown eficiente em telas de grande porte. Esse protocolo utiliza uma alimentação de dsRNA disponível comercialmentebiblioteca e descreve todos os passos necessários para duplicar a biblioteca e executar telas dsRNA. O protocolo não requer a utilização de equipamentos sofisticados, e, portanto, pode ser realizada por qualquer C. elegans laboratório.
Introduction
Historicamente, telas genéticas em C. elegans foram realizados pelo tratamento dos animais com um agente mutagénico químico tal como metanossulfonato de etilo para criar mutações aleatórias no DNA. Descendência ou seus netos de animais mutagenizadas são então isolados que exibem um fenótipo anormal desejado. A mutação responsável por causar o fenótipo é, então, identificado através de um procedimento de mapeamento de trabalho intensivo ou por sequenciar todo o genoma do verme mutante. Há muitas vantagens para a realização de tais telas mutagênese química como eles criam lesões permanentes dentro do genoma verme que pode resultar em ambos os fenótipos ganho de função e perda de função, mas o procedimento de mapeamento é lento e caro.
Interferência de RNA de cadeia dupla (dsRNAi) fornece um meio alternativo para identificar genes envolvidos em processos biológicos importantes. Neste método, o dsRNA correspondentes da sequência de codificação de um gene endógeno é introduzido no verme.O dsRNA é processado in vivo para gerar pequenas (21-22 nucleotídeos) RNAs que servem como guias para encontrar e ligar os mRNAs endógenos correspondentes, orientando-as para a destruição 1. Este procedimento é relativamente rápido, mas porque o dsRNA tem como alvo ARNm, em vez de ADN, apenas fenótipos redução de função são observadas utilizando esta abordagem.
Introdução de dsRNAs em um animal pode ser conseguida por injecção directa de dsRNA 2, por imersão em animais dsRNA 3, ou por alimentação de animais, bactérias que expressam ARNcd 4. Cada um destes métodos de entrega de provocar efeitos sistémicos knockdown como a maioria das células do animal expressar SID-1, um canal transmembranar capaz de importar dsRNA 5. Originalmente utilizada como uma abordagem genética reversa para knockdown a expressão de genes individuais, uma de cada vez, o desenvolvimento de duas bibliotecas de alimentação permite agora telas genéticos em grande escala. As bibliotecas de dsRNA comercialmente disponíveis contêm baclones cterial representando ou 55% ou 87% de todo o C. elegans genes 6, 7.
Infelizmente, em grande escala telas alimentação dsRNAi muitas vezes resultam em eficiência knockdown variáveis 8-10. Enquanto o nível absoluto de knockdown por RNAi não é facilmente medido, a eficiência knockdown reduzido observado em telas de grande porte deve ser causada por mRNAs específicos de genes residuais que escapam da degradação por RNAi. Este, por sua vez, pode ser um resultado direto da perda de dsRNA plasmídeo a partir de bactérias alimentadas aos animais nessas telas. Apoiar essa idéia, os animais alimentados com misturas de bactérias, em que apenas 50% das bactérias expressar dsRNAs contra um gene alvo, mostram dramaticamente reduzida (se houver) efeitos knockdown quando comparado ao grupo controle alimentado 11. A extensão do knockdown do gene torna-se uma preocupação crítica ao realizar telas dsRNAi como a maioria dos genes em C. elegans são haplosufficient e, assim, a expressão de genes deve ser reduzido em pelo menos 50% to causar de perda de função fenótipos 12.
Usamos protocolos de alimentação publicados anteriormente para executar telas em grande escala e encontrou os mesmos efeitos knockdown variáveis relatados por outros 8-10. Em uma pesquisa de possíveis causas, descobrimos que quase 60% das bactérias alimentação de animais na tela tinha perdido o plasmídeo dsRNA. Nós desenvolvemos um protocolo de duplicação e triagem de biblioteca que reduz drasticamente ou elimina a perda de plasmídeo e melhora a eficiência knockdown. Este protocolo é adequado para a realização de telas de grande escala em C. elegans e pode ser utilizado para rastrear qualquer uma das bibliotecas de dsRNA disponíveis comercialmente. Usando este protocolo, descobrimos que essencialmente 100% das bactérias administradas aos animais durante o ecrã reter o dsRNA plasmídeo e causar perda robusto e altamente penetrante de fenótipos funcionais em todos os tecidos examinados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um protocolo que utiliza uma biblioteca de alimentação dsRNA comercialmente disponível para realizar telas de grande escala em C. elegans. Nós fornecemos todas as instruções para duplicar a biblioteca e para usá-lo de forma eficaz. Nós demonstramos que este método é capaz de identificar genes envolvidos em diferentes processos biológicos em diferentes tecidos do animal. Enquanto os fenótipos aqui descritos são facilmente observáveis (Unc, Egl, e dpy), este protocolo pode ser…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos dos Institutos Nacionais de Saúde MH097163. Algumas cepas foram fornecidos pelo CGC, que é financiado pelo Escritório de Investigação NIH Programas de Infra-estrutura (P40-OD010440).
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
Referências
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