本文介绍的程序幼鼠的触觉刺激和神经元形态的后续高尔基 – 考克斯染色。触觉刺激是受抚摸幼崽与家用除尘器投在围产期一个积极的经验。高尔基体的cox染色是一种可靠的方法,允许整个神经元的可视化。
为了产生行为的长期变化,经验必须在生产神经元形态和突触连接的稳定变化。触觉刺激是一个积极的早期经验,模仿产妇舔和修饰大鼠。暴露幼鼠这个积极的经验,可以通过使用非常方便的材料,如一个家庭掸子轻松且经济高效地完成。使用跨垃圾设计,幼仔要么抚摸或静置,15分钟,每天三次在整个围产期。测量与此相关的阳性早期经验的神经可塑型变化,脑组织中的高尔基体考克斯染色被利用。由于该高尔基考克斯浸渍染色离散神经元的数目,而不是所有的细胞的事实,所述啮齿动物的脑与高尔基体考克斯溶液的染色使得整个神经元素,包括细胞体,树突,轴突的可视化,并树突棘。在染色过程中,我s进行了数天,并要求研究人员密切关注细节。然而,一旦染色完成后,整个大脑已经浸渍和可无限期保存正在进行的分析。因此,高尔基体考克斯染色是研究经验依赖性可塑性的宝贵资源。
虽然有许多报道和利用技术的负面早期经验对大脑的成熟,如围产期应激1,2,感觉剥夺3,药物的毒副作用4考试,有来检查的积极经验的影响非常少的方法这个时间段。除了 丰富环境,触觉刺激是几大脑加强与展示效果5疗程之一。触觉刺激的感官刺激,模仿母亲的行为鼠,舔和修饰皮肤的方法。其普遍接受作为一个积极的操作来自研究表明触觉刺激改善早产儿和新生儿大鼠6成熟。此外,研究在实验室米尼7表明,较高水平的孕产妇舔和仪容产品都与后代的积极成果。由于到T灰褐色的积极影响,触觉刺激迅速演变成一个补救战略,旨在减少焦虑8,改善与脑损伤有关的9-11的结果,并减弱药物过敏12。因此,触觉刺激是一个有价值的技术,以促进积极的早期经验,具有公认的能力大幅改组神经元形态和发育中的大脑的突触连接。
为了检查和定量改变神经元的形态,它是必要的可视化完好的神经元。高尔基-考克斯染色过程是刊登在1800年代后期卡米洛高尔基的技术,提供少数完整的神经元13离散染色的修改。虽然过程会出现染色神经元随机和再现性普遍提及的重大缺陷,整个神经元的小浸渍速度许可证可视化,包括CELL体,树突,树突棘和轴突。同样,浸渍给定的大脑与高尔基体解决方案所需的时间也被认为是一个垮台。不过,由于一旦染色完成组织可以无限期保存,和神经元用显微镜的大脑和可视化的灌注之间的时间不到21天完成,时间周期是没有道理的。此外,稍加修改的协议,高尔基 – 考克斯染色可有效地用于所有年龄段浸渍啮齿动物的大脑。由于在结构层面的变化都与执着的修改行为和心理功能,高尔基 – 考克斯染色技术为研究人员提供了一个宝贵的工具来测量神经可塑性。
由于发育中的大脑的可塑性明显,但重要的是,涉及早期经历的实验步骤进行彻底检讨,并尝试都是为了控制所有中介变项。出于这个原因,一个横垫料设计的触觉刺激过程期间使用,以确保幼仔被接收在发展的所有其他域类似的经历。此外,它也是重要的,从多个窝幼仔多个被选择用于分析,以避免影响来自于单一小狗或垫料的偏压导致的可能性。
触觉刺激被认为是模仿天然存在的母体行为,舔和修饰,这被认为是给子代发育有利。虽然之前的研究强调生命的第一周(P0-P7)是为舔和梳理16的关键时期,变革的庞大规模确定以下18天TA的ctile刺激可能意味着,虽然敏感时期存在的,较长的曝光优越。同样重要的是要注意,接受触觉刺激在这个实验范式的幼仔也经历舔和修饰由他们的母亲,因此触觉刺激是除了正常的刺激由母亲管理。最后,我们还必须认识到的区域依赖性变化。虽然在开发过程中的触觉刺激前额叶皮质树突增加的复杂性,这并不能保证这种性质的结构性变化将体现在所有大脑区域。这可能是在其他脑区如顶叶皮层神经元形态,会在一个截然不同的方式,以同样的经历作出回应。然而,由于触觉刺激程序是容易施用并不会带来任何危险的后代或水坝,它具有以作为许多研究,旨在改善发展的有价值的工具的潜在人的结果。
相对于脑组织的高尔基体考克斯染色,是对神经元细胞的成功的可视化的关键步骤如下:1)必须有大脑用生理盐水溶液充分灌注。脑组织导致血管文物,使其难以实际上是通过血管的迷宫可视化的神经元细胞,同时也复杂拍摄染色神经元的能力,不当或不充分灌注。 2)灌注的大脑应该存储在高尔基体考克斯溶液并在黑暗中的蔗糖溶液。存储所述的脑组织在黑暗中减少了组织的背景染色,再增加成功可视质量的神经元细胞的机会。 3)脑组织被存储在以下第14天存储在高尔基体考克斯溶液的蔗糖溶液。当组织浸没在2-5天的30%蔗糖溶液,大脑更柔韧,防止粉碎和撕裂部分的时切割。它以防止残留在增加的时间段的蔗糖溶液的脑组织(除蔗糖溶液连续用新鲜溶液替换)因为长期贮存中蔗糖降低了染色质是重要的。 4)最后,一旦幻灯片已染色和盖下滑,就应该给他们足够的时间可视化前的干燥用显微镜。如果幻灯片是不允许的充分风干,该组织可能会变暗,降低皮层神经元的成功可视化。
在心理功能和行为反应发生在回应经验稳定的变化被认为是由神经元形态和突触连接17的重组提供便利。由于这些结构变化的经验依赖性可塑性提供了一个可衡量的资源,使用可靠染色过程中是非常重要的。这vibratome基于高尔基 – 考克斯染色过程提供可靠的污点ING精分支和树突棘,可能不会很明显与其它协议如火棉胶嵌入的。在高尔基体考克斯程序的独特性源于其容量仅染色的神经元元件(1-10%),其允许单个神经元的跟踪长距离的一小部分。尽管神经元的只有一小部分被浸渍有污垢,所呈现的可见细胞,维持所有的功能,包括细胞体,树突,树突棘和轴突。此外,当染色过程是否正确执行,染色细胞中脱颖而出清楚而明确地对一个透明的背景,因为其他的皮层结构仍然未染色和透明。由于认识到在向外运作持续变化,必须进行相关的神经系统的可塑性, 即神经元来修改它们的结构和连接能力,高尔基-考克斯染色过程为研究人员提供一个可靠的技术来可视化和量化这种可塑性。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由NSERC补助BK和RG资助。作者还要感谢科和谢和罗素Hosain他们高尔基 – 考克斯染色的专业知识。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |