डीएनए Glycosylase गतिविधि के लिए स्थिर राज्य, पूर्व स्थिर राज्य, और एकल कारोबार काइनेटिक मापन
Summary
8 oxoguanine डीएनए glycosylase की glycosylase गतिविधि के लिए समय पाठ्यक्रमों उत्पाद गठन और एक रेखीय स्थिर राज्य चरण का फट प्रदर्शन biphasic हैं. क्रमशः, 8 oxoguanine और उत्पाद डीएनए से glycosylase की रिहाई की छांटना के अनुरूप जो बुझाना प्रवाह तकनीक, फट और स्थिर राज्य दरों मापा जा सकता है, का उपयोग.
Abstract
मानव 8 oxoguanine डीएनए glycosylase (OGG1) डीएनए से mutagenic oxidative डीएनए घाव 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8 oxoG) excises. OGG1 की काइनेटिक लक्षण वर्णन 8 oxoG छांटना और उत्पाद जारी करने की दर को मापने के लिए किया जाता है. OGG1 एकाग्रता सब्सट्रेट डीएनए से कम है, उत्पाद के गठन के समय पाठ्यक्रम biphasic हैं, उत्पाद निर्माण की एक तेजी घातीय चरण (यानी फट) एक रेखीय स्थिर राज्य चरण के बाद है. उत्पाद गठन की प्रारंभिक फट ठीक सब्सट्रेट पर लगे एंजाइम की एकाग्रता से मेल खाती है, और फट आयाम एंजाइम की एकाग्रता पर निर्भर करता है. फट से लगातार पहली आदेश दर 8 oxoG छांटना की आंतरिक दर से मेल खाती है और धीमी गति से स्थिर राज्य दर उत्पाद जारी (निरंतर उत्पाद डीएनए हदबंदी दर, कश्मीर बंद) की दर के उपाय. यहाँ, हम स्थिर राज्य, पूर्व स्थिर राज्य, और एकल कारोबार दृष्टिकोण सपा को अलग करने और मापने के लिए वर्णनOGG1 उत्प्रेरक साइकिल चालन के दौरान ecific कदम. एक फ्लोरोसेंट लेबल घाव युक्त oligonucleotide और शुद्ध OGG1 सटीक गतिज माप की सुविधा के लिए उपयोग किया जाता है. कम एंजाइम सांद्रता स्थिर राज्य माप, प्रतिक्रिया के अभिकर्मकों के मिश्रण का मार्गदर्शन और शमन बनाने के लिए उपयोग किया जाता है के बाद से स्थिर राज्य दर (कश्मीर बंद) का पता लगाने के लिए किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, शून्य समय में तालमेल पर एक बिंदु पर स्थिर राज्य दर के निष्कर्षों उत्पाद गठन के एक फट पहले कारोबार (यानी Y-अवरोधन सकारात्मक है) के दौरान हुई कि इंगित करता है. घातीय फट चरण की लगातार पहली आदेश दर स्थिर राज्य चरण से पहले कम समय के अंतराल (<1 सेकंड) पर गठित उत्पाद की मात्रा की जाँच और 8 की दर से मेल खाती है कि एक तेजी से मिश्रण और शमन तकनीक का उपयोग करके मापा जा सकता है -oxoG छांटना (यानी रसायन शास्त्र). उत्प्रेरक सायकलिंग है जहां रासायनिक कदम भी एक एकल कारोबार के दृष्टिकोण का उपयोग करके मापा जा सकता हैएंजाइम (ई> एस) के साथ saturating सब्सट्रेट डीएनए से रोका. इन तरीकों एक डीएनए घाव को हटाने की दक्षता को प्रभावित करती है कि प्राथमिक दर स्थिरांक उपाय कर सकते हैं.
Introduction
एक एरोबिक वातावरण जीनोमिक अस्थिरता उतावली. Oxidative तनाव से उत्पन्न एक प्रमुख promutagenic डीएनए घाव 7,8-Dihydro-8-oxoguanine (8 oxoG) है. यह 8 oxoG की अस्पष्ट कोडिंग की क्षमता की वजह से है. मानव 8 oxoguanine डीएनए glycosylase (OGG1) 8 oxoG के आधार काटना की मरम्मत शुरू करने के लिए जिम्मेदार है. OGG1 की glycosylase गतिविधि एक apurinic साइट (एपी साइट पर) के साथ उत्पाद डीएनए में जिसके परिणामस्वरूप 8 oxoG आधार excises. OGG1 की एक कमजोर lyase गतिविधि कुछ उदाहरणों में एपी साइट काटकर अलग कर सकते हैं.
डीएनए glycosylases की काइनेटिक लक्षण वर्णन आम तौर पर वे biphasic समय पाठ्यक्रमों कि प्रदर्शन पाता है. उत्पाद गठन की एक शुरुआती तेजी चरण (यानी फट) के बाद, एक रेखीय स्थिर राज्य चरण 1-3 मनाया जाता है. यह व्यवहार बर, जबकि रसायन शास्त्र (यानी गठनात्मक परिवर्तन या उत्पाद विज्ञप्ति) समय पाठ्यक्रम के रैखिक भाग के दौरान दर सीमित किया जा रहा है के बाद एक कदम का संकेत हैअक्सर क्षणिक चरण के रूप में भेजा सेंट चरण,, प्रतिक्रिया के पहले चक्र के दौरान एंजाइम सक्रिय स्थल पर उत्पाद गठन से मेल खाती है. उत्पाद जारी स्थिर राज्य चरण के दौरान सीमित दर है, जब गतिविधि माप उत्पाद डीएनए बंधन आत्मीयता की एक गुणात्मक उपाय प्रदान करते हैं, लेकिन एंजाइम सक्रिय साइट (यानी रसायन शास्त्र) में घटनाओं के विषय में गतिज जानकारी प्रदान नहीं करते हैं. तदनुसार, घातीय पूर्व स्थिर राज्य फट चरण अलग करने और मापने के लिए तरीकों एंजाइम सक्रिय साइट 4 में पहले enzymatic कारोबार के दौरान की घटनाओं की जांच के लिए आवश्यक हैं.
(1) स्थिर राज्य, (2) पूर्व स्थिर राज्य, और (3) एकल कारोबार OGG1 का उत्प्रेरक व्यवहार को चिह्नित करने के लिए तीन मानक गतिज दृष्टिकोण, वहाँ रहे हैं. इन तरीकों प्रतिक्रिया मिश्रण में एंजाइम की एकाग्रता और प्रत्येक दृष्टिकोण में उपयोग किया सब्सट्रेट के अनुपात में एंजाइम द्वारा एक दूसरे से अलग. एक ठेठ स्थिर राज्य दृष्टिकोण में,कभी कभी कई कारोबार कैनेटीक्स के रूप में भेजा, एंजाइम की कम मात्रा उत्पाद गठन का पालन करने के लिए उपयोग किया जाता है. कई एंजाइमी टर्नओवर काफी सब्सट्रेट एकाग्रता प्रभावित नहीं करते कि इतना सब्सट्रेट एकाग्रता बहुत एंजाइम एकाग्रता से अधिक है. इस स्थिति में, समय पाठ्यक्रम रैखिक होना चाहिए और यह एक फट इस दृष्टिकोण में इस्तेमाल कम एंजाइम एकाग्रता की वजह से पहले कारोबार के दौरान हुई कि क्या विचार करने के लिए कई बार मुश्किल है, ध्यान दें फट आयाम एंजाइम एकाग्रता के बराबर है. यह एक उच्च एंजाइम एकाग्रता का उपयोग करते हुए और पहले enzymatic कारोबार जल्दी हुआ कि क्या पता लगाने के लिए शून्य समय रैखिक समय पाठ्यक्रम extrapolating द्वारा दूर किया जा सकता है. तालमेल पर अवरोधन (शाफ़्ट) एंजाइम एकाग्रता के लिए आनुपातिक होना और सक्रिय रूप से सब्सट्रेट के साथ लगे हुए एंजाइम का एक उपाय प्रदान करना चाहिए. इस दृष्टिकोण के सिद्धांत में एक फट चरण के अस्तित्व के लिए सबूत है, एक अलग प्रदान कर सकते हैंअलग दृष्टिकोण फट चरण के कैनेटीक्स को मापने के लिए आवश्यक है. कई मामलों में फट चरण मार्गदर्शन मिला और शमन तकनीक से मापने के लिए भी तेजी है. इस स्थिति में, पूर्व स्थिर राज्य और एकल कारोबार गतिज (यानी क्षणिक गतिज) अक्सर एक प्रतिक्रिया 5 के शुरुआती समय बिंदुओं का पालन करने के लिए एक तेजी से मिश्रण और शमन साधन की आवश्यकता दृष्टिकोण. एक पूर्व स्थिर राज्य दृष्टिकोण में एंजाइम की उच्च सांद्रता उत्पाद का एक महत्वपूर्ण राशि पहले कारोबार के दौरान गठन किया गया है ताकि उपयोग किया जाता है. कई टर्नओवर उत्प्रेरक साइकिल चालन (यानी फट है कि इस प्रकार रैखिक चरण) का निरीक्षण करने के लिए पीछा कर रहे हैं, सब्सट्रेट एकाग्रता एंजाइम एकाग्रता ([एंजाइम] <[सब्सट्रेट]) से अधिक है. उत्प्रेरक साइकिल चालन के बिना एंजाइम सक्रिय स्थल पर घटनाओं को अलग करने के लिए, एकल कारोबार शर्तों का उपयोग किया जाता है. इस मामले में, सब्सट्रेट सब्सट्रेट के सभी मैं भाग लेने के लिए इतना है कि (ई >> एस) एंजाइम के साथ संतृप्त हैएन 'एकल कारोबार' और आम तौर पर एक एकल घातीय समय पाठ्यक्रम प्रदर्शन करेंगे.
एक फट चरण, उत्पाद जारी (कश्मीर बंद) है कि प्रदर्शन एंजाइमों के लिए ऊपर के रूप में विख्यात अक्सर समय निश्चित रूप से स्थिर राज्य चरण की दर को सीमित करता है. उत्पाद जारी (वी एस एस, सान्द्र. / समय) की दर रैखिक स्थिर राज्य चरण की ढलान से निर्धारित किया जा सकता है. सक्रिय एंजाइम एकाग्रता (ई) लगातार एक आंतरिक मूल्यांकन करने के लिए उत्पाद की रिहाई की दर बदलने की जरूरत है जहां कश्मीर बंद = वी एस एस / [ई]. महत्वपूर्ण बात है, सक्रिय एंजाइम एकाग्रता दोष के कारण मापा प्रोटीन एकाग्रता, निष्क्रिय एंजाइम, एंजाइम गैर उत्पादक सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य है, और प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण किया जाता विधि की तुलना में आम तौर पर कम है. उत्पाद जारी धीमी है जब सक्रिय एंजाइम एकाग्रता फट आयाम से निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रकार, के लिए एक स्थिर राज्य समय पाठ्यक्रम extrapolatingशून्य समय मनाया स्थिर राज्य दर से कश्मीर बंद (उत्पाद जारी) की गणना करने के लिए आवश्यक रूप से सक्रिय एंजाइम के एक अनुमान प्रदान करता है.
पटाखे के कैनेटीक्स को मापने के लिए, एक पूर्व स्थिर राज्य दृष्टिकोण रैखिक स्थिर राज्य चरण से पहले होता है कि पहले कारोबार के दौरान उत्पाद गठन का पालन करने के लिए आवश्यक है. फट कैनेटीक्स एंजाइम उत्पाद मध्यवर्ती के गठन इस प्रकार है. प्रतिक्रिया सब्सट्रेट के साथ मिश्रण एंजाइम द्वारा शुरू की है एक बार प्रतिक्रिया एक स्थिर राज्य चरण तक पहुँच जाता है, जब तक एंजाइम उत्पाद की मात्रा तेजी से बढ़ जाती है. कटैलिसीस और अधिक तेजी से उत्पाद जारी करने से है, तो फट के आयाम को संभालने, उत्पाद के लिए सब्सट्रेट के रासायनिक रूपांतरण की दर से मेल खाती है संतुलन के लिए सक्रिय रूप से लगे हुए एंजाइम और मनाया घातीय दृष्टिकोण (कश्मीर ओ बीएस) के बराबर है कि रिवर्स दर रसायन शास्त्र नगण्य है.
कुछ उदाहरणों उत्प्रेरक cy मेंचिपकी इस तरह के रसायन शास्त्र और उत्पाद जारी करने के लिए दरों का परिमाण काफी अलग नहीं कर रहे हैं के रूप में एक पूर्व स्थिर राज्य विश्लेषण, के साथ हस्तक्षेप. इस मामले में, सब्सट्रेट करने के लिए अतिरिक्त एंजाइम रिश्तेदार को रोजगार एक भी कारोबार के लिए एंजाइम के साथ ही उत्प्रेरक साइकिल और सीमा सब्सट्रेट से बचाता है. पहली आदेश दर लगातार कश्मीर (ओ बीएस) के रूप में तदनुसार प्रतिक्रिया की पहली रासायनिक कदम अलग किया जा सकता है और इसे सही निर्धारित की. लगातार इस दर ओ बीएस कश्मीर के समान ऊपर वर्णित पूर्व स्थिर राज्य दृष्टिकोण से निर्धारित किया जाना चाहिए.
यहाँ हम इन गतिज दृष्टिकोण OGG1 की glycosylase गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन कैसे.
Protocol
Representative Results
Discussion
गतिज दृष्टिकोण प्राथमिक गतिज स्थिरांक को परिभाषित करने के तरीकों की रूपरेखा यहाँ वर्णित है. उत्पाद गठन के एक समय के पाठ्यक्रम पहले enzymatic कारोबार तेजी से होने वाली साथ biphasic है, तो रसायन शास्त्र के बाद एक कद…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपयोगी सुझाव और विचार विमर्श के लिए पांडुलिपि और डा. राजेंद्र प्रसाद की महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. जूली लालकृष्ण होर्टन धन्यवाद. इस शोध के अंश मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान, Sassa एक एट के जर्नल में प्रकाशित किए गए थे. अल., "मानव 8 Oxoguanine डीएनए Glycosylase की Glycosylase गतिविधि पर डीएनए अनुक्रम प्रसंग प्रभाव." जम्मू बॉय केम. 287, 36702-36710 (2012) 2. इस काम के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम में स्वास्थ्य अनुसंधान परियोजना अनुदान Z01-ES050158 के राष्ट्रीय संस्थान, NIEHS द्वारा, पूरे या हिस्से में, का समर्थन किया था.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
Referências
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Bioquímica. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a “pinch-pull-push” mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg, ., Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Bioquímica. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Bioquímica. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Bioquímica. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Bioquímica. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Bioquímica. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Bioquímica. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Bioquímica. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Bioquímica. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
