グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール
Summary
この記事では、高い空間的および時間的な精度を持つシナプス信号の統合を調査するための技術として、神経伝達物質の高速マイクロイオン導入をご紹介します。
Abstract
神経科学の根本的利益の一つは、最終的には軸索における活動電位の神経出力につながる樹木、非常に複雑な構造に沿って興奮性と抑制性入力の統合を理解することです。ニューロンの出力上の特定のシナプス入力の多様な空間的および時間的パラメータの影響は、樹状入力の距離依存減衰、空間的に分離され、入力の場所に依存した相互作用、興奮統合、線形上GABAergig阻害の影響を、たとえば 、現在調査中ですと非線形統合モード、および多く。
グルタミン酸およびGABAの迅速なマイクロイオン導入で、それは正確にグルタミン酸作動性興奮及び抑制の空間的および時間的統合を調査することができる。重大な技術的要件は、トリガ蛍光灯、発光ダイオード（LED）、または2つの光子SCAある組織の有意な光損傷を導入することなく樹枝を可視化する顕微鏡nning。また、高抵抗ピペットの迅速な容量補正を可能にするマイクロイオントフォレーシス増幅器を有することが非常に重要である。もう一つの重要なポイントは、送信機が思わず実験中にピペットで放出されていないということです。
いったん確立された、この手法は、高い神経伝達物質と位置特異性で信頼性と再現性のあるシグナルを与える。グルタミン酸やGABAアンケージングに比べて、高速イオン導入は視野に限定することなく、同時に、非常に遠い場所で両方のトランスミッタを使用できます。軸索の焦点電気刺激と比較して利点もある。マイクロイオントフォレシス、入力部位の位置が明確に知られており、それが関心のある神経伝達物質のみが解除されていることを確認される。しかし、それだけで、マイクロイオントフォレシスであることを考慮する必要がありポストシナプスが活性化され、神経伝達物質の放出のシナプス前側面が解決されません。この記事では、脳スライス実験でマイクロイオントフォレシスを設定する方法を示します。
Introduction
中枢神経系のニューロンは、その薄いと分岐した樹状プロセス1のシナプス入力の様を受け取る。そこに、興奮性樹入力の大部分は、グルタミン酸作動性シナプスによって媒介される。これらのシナプスは、興奮性シナプス後電位（EPSPを）のシナプス後線形統合で、その結果、空間的に分散した方法で起動することができます。シナプスが同時にと樹状突起上の空間的に近接して活性化される場合、これらの興奮性入力は上記非線形統合されており、樹状突起スパイク2-5を生成することができます。
さらに、興奮性入力の統合は、樹状ツリー上の入力の場所によって異なります。遠房地域に到着した信号は、はるかに減衰ケーブルフィルタ6のために近位の入力よりも。海馬では、尖タフト樹状突起への遠い入力は近dendri上のものとは異なる脳の領域によって生成されTES 7。刺激的な質問は、異なる樹状コンパートメントによって樹状統合は、さまざまな方法で神経発火でこれらの階層の入力の影響を調整した場合どのように処理されるかシナプス入力、ことである。
機能特性、樹状突起の形態的な特徴だけでなく、入力の場所とクラスタリングは決定的にグルタミン酸作動性シナプス8,9の有効性を決定することも興奮性入力が、GABA作動性の端末からの追加の抑制性入力の樹統合に影響を与えている。シナプス統合のこれらの様々な側面は、理想的には、樹状ドメインに別の神経伝達物質の空間的に定義されたアプリケーションを可能にする神経伝達物質のマイクロイオン導入を用いて調査することができます。我々は成功したニューロンに信号積分を調査するために、グルタミン酸とGABAのマイクロイオントフォレシスを確立する方法をここに示しています。
このアプリケーションでは、先の細い濃縮された神経伝達物質溶液を充填した高抵抗ピペットが使用される。これらのピペットは、神経伝達物質受容体が位置するセルの外膜に近接して配置されている。樹枝の良い可視化が必要である。これは、最良のパッチピペットを介して導入される蛍光色素を用いて達成される。その後、非常に短い（<1ミリ秒）パルス電流（10の範囲内の – 100 nAの）を入れ、神経伝達物質の分子を取り出すために使用されます。これらの短いパルスと実効容量の補償と、シナプス後電位または電流は興奮性入力の位置が正確に分かっていることを意味する高い時間·空間的精度を誘発することができます。グルタミン酸マイクロイオン導入（ 図1 9）ここに示されているように6未満である定義された半径内にシナプスを活性化することができますが、それは、単一シナプス決議10-12を達成することも可能です。
ハイネ、M. ら </emは>その空間分解能を示したの速いマイクロイオン導入であっても定期的にグルタミン酸13の二光子アンケージングで達成スポットサイズよりも小さい場合は0.5μm、以下のサイズを見つけるために調整することができます。高速のマイクロイオントフォレシスでは、2つまたはそれ以上のイオン泳動ピペットを使用して、樹状突起で異なる、さらに遠い箇所にそれらを配置することが容易に可能である。このように、異なる経路からのものを含む興奮性事象の統合を検討することができる。それは同時にグルタミン酸とGABA充填されたイオン導入ピペットを使用することも可能である。このようにして興奮入力（オンパス、オフ経路阻害）に対して異なる位置におけるGABA作動性抑制の効果を研究することができる。また、特定の神経細胞のドメインを標的とする介在による阻害の影響は、遠位樹状突起のように、ソーマまたは軸索14は 、GABAイオン導入を用いて検討することができます。培養神経細胞では、高速のマイクロイオントフォレシスはinveの機会を提供しています単一のシナプス分布とはるかに詳細10,11のニューロンにおけるシナプス伝達の基本側面をstigate。
この記事では、入力位置、入力強度、タイミング、単独または相互作用での依存性に興奮性と抑制性入力のシナプス統合を調査可能に急性脳スライス、で使用するためのグルタミン酸やGABAイオントフォレシスを確立する方法を詳細に示しています。私たちは、この技術の利点と限界を指摘し、どのように成功したトラブルシューティング方法になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、樹状突起上のシナプス統合を調査するために、神経伝達物質の高速マイクロイオントフォレシスを適用する方法を説明します。この技術は、正常in vitroおよびin vivo 9,20-22 で異なる脳領域におけるグルタミン酸とGABA作動性シナプス伝達を調査するために使用されている。マイクロイオントフォレーシスは60年以上も使用されてきたが、初期の頃には主に、ロー?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は慎重に原稿を読み取るためのハンス·ライナー干拓、マーティン·フールマンとウォーカージャクソンに感謝します。 、神経変性疾患におけるセンター·オブ·エクセレンス（COEN、著者は、国家ノルト-ウェストファリア（SR）、計算論的神経科学におけるBMBF-ProjekträgerDLR米国ドイツコラボレーション（SR CRCNS）の研究MIWF省から提供された資金提供を受けた; SR）、およびボン大学学内資金調達プログラム（BONFOR; SR）。
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
Referências
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