विच्छेदन और zebrafish भ्रूण की लेटरल बढ़ते: रीढ़ की हड्डी के विकास का विश्लेषण

Summary

इस तरह के प्रसार, patterning, भेदभाव, और अक्षतंतु मार्गदर्शन के रूप में विकास की प्रक्रिया तत्काल zebrafish रीढ़ की हड्डी में मॉडलिंग की जा सकती. इस अनुच्छेद में, हम इन घटनाओं के दृश्य जो अनुकूलन, zebrafish भ्रूण के लिए एक बढ़ते प्रक्रिया का वर्णन.

Abstract

zebrafish रीढ़ की हड्डी में कई कारणों से तंत्रिका तंत्र में अनुसंधान के लिए एक प्रभावी खोजी मॉडल है. सबसे पहले, आनुवंशिक, ट्रांसजेनिक और जीन पछाड़ना दृष्टिकोण तंत्रिका तंत्र के विकास अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. दूसरा, developmentally सिंक्रनाइज़ भ्रूण की बड़ी चंगुल बड़े प्रयोगात्मक नमूना आकार प्रदान करते हैं. तीसरा, zebrafish भ्रूण की ऑप्टिकल स्पष्टता पूर्वज, glial, और neuronal आबादी कल्पना करने के लिए शोधकर्ताओं ने परमिट. Zebrafish भ्रूण पारदर्शी हैं, नमूना मोटाई प्रभावी सूक्ष्म दृश्य बाधित कर सकते हैं. इसका एक कारण रीढ़ की हड्डी और overlying विखंड ऊतक का मिलकर विकास है. दूसरा कारण यह अभी भी जल्दी neurogenesis की अवधि के दौरान मौजूद है जो बड़े जर्दी गेंद, है. इस अनुच्छेद में, हम microdissection और विखंड ऊतक आसपास के संरक्षण, जबकि सूक्ष्म दृश्य की अनुमति देता है, जो तय भ्रूण में जर्दी, को हटाने का प्रदर्शन. हम ए एल एसओ zebrafish भ्रूण की semipermanent बढ़ते प्रदर्शित करता है. यह ऊतक के तीन dimensionality को बरकरार रखता है, क्योंकि यह dorso-उदर और पूर्वकाल पीछे कुल्हाड़ियों में सक्षम के चिकित्सकों का अवलोकन परमिट.

Introduction

Zebrafish में रीढ़ की हड्डी के दृश्य के कारकों में से एक नंबर से हिचकते हैं. कारण overlying somites की मोटाई और रीढ़ की हड्डी का आंतरिक स्थान पर, एक काफी लंबे समय तक काम दूरी उच्च सेलुलर संकल्प के लिए आवश्यक है. (neurogenesis के प्रारंभिक दौर के दौरान अभी भी मौजूद है) की जर्दी गेंद आगे आवश्यक काम दूरी बढ़ जाती है, और आसानी से एक coverslip के दबाव से क्षतिग्रस्त है. इसके अलावा, क्षतिग्रस्त जर्दी से मलबे ऊतकों का स्पष्ट दृश्य पर प्रतिबंध लगाता है. Dorso-उदर (डीवी) अक्ष में पार वर्गों संभव हो रहे हैं, वे आसानी से पूर्वकाल पीछे (एपी) धुरी ¹ में एक साथ दृश्य की अनुमति नहीं देते.

इन बाधाओं को दूर करने, भ्रूण स्लाइड पर विच्छेदित और बढ़ रहे हैं. यह प्रक्रिया कई लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, zebrafish भ्रूण आसानी से पार्श्व पक्ष एपी अक्ष दृश्य की सुविधा है, जो ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ झूठ. जर्दी बाल का दूसरा, हटानेएल आवश्यक काम दूरी कम हो जाती है, और मलबे की सीमा. तीसरा, इस बढ़ते प्रक्रिया फ्लोरोसेंट और brightfield माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए अनुमति देता है. चौथा, घुड़सवार भ्रूण लम्बी नमूना दृश्य की अनुमति, 4 डिग्री सेल्सियस पर महीनों के लिए स्थिर रहे हैं. अंत में, विकास की प्रगति कि पूर्वकाल क्षेत्रों में होता है पीछे क्षेत्रों की तुलना में अधिक परिपक्व हो रहे हैं. मंचन मिलान किया रीढ़ की hemisegments भ्रूण के बीच तुलना की जाती है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, overlying विखंड ऊतक एक गाइड के रूप में प्रयोग किया जाता है. उदाहरण के लिए, दसवां सबसे पीछे विखंड चरण से मिलान भ्रूण में विकासात्मक बराबर है जो दसवें रीढ़ की hemisegment, overlies. बरकरार भ्रूण के इस बढ़ते प्रक्रिया somites की आसानी से पहचान की अनुमति देता है.

हम विकासशील रीढ़ की हड्डी में अक्षतंतु मार्गदर्शन के तंत्र का अध्ययन करने के आनुवंशिकी और जीन दस्तक नीचे प्रौद्योगिकियों का उपयोग करें. विशेष रूप से, हम robo2, robo3, और डीसीसी जोड़ संबंधी प्राथमिक ASCE के लिए आवश्यक हैं कि निर्धारित किया हैnding (कोपा) अक्षतंतु pathfinding. यहाँ वर्णित बढ़ते प्रक्रिया का उपयोग करना, हम उदर विकास, midline पार, संयोजिका चौड़ाई, पृष्ठीय और पूर्वकाल विकास ^2,3 जांच कर रहे थे. इस बढ़ते प्रक्रिया भी DV या रीढ़ की हड्डी के एपी patterning के लिए लागू किया जा सकता है. हम रीढ़ की हड्डी की DV patterning में नीचे की ओर Wnt effectors के असमान भूमिकाओं का निर्धारण करने के लिए इस प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है. इस बढ़ते उपयोग करना, हम एकल कोशिका के स्तर पर DV मार्करों के प्रस्ताव प्राप्त, और बदल Wnt संकेत स्वागत ^4,5 के परिणामस्वरूप मिनट patterning पारियों निर्धारित करने में सक्षम थे. इस बढ़ते प्रक्रिया भी विरोधी phosphohistone 3 या BrdU लेबलिंग (पूर्वज प्रसार) भेदभाव से ^{5 तक} mitotic सूचकांक की गणना के लिए अनुमति देता है.

Protocol

1. भ्रूण बढ़ते (जैसे Immunocytochemistry के रूप में चयनित दृश्य तकनीक, के पूरा होने पर, बगल में संकरण में, आदि) चुनाव के बफर (चित्रा 1 ए) के साथ भरा एक 35 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण रखें. बफर का चुनाव लेबलिंग प्रक्रिया पर आधारित है. आमतौर पर पीबीएस आधारित बफ़र्स उपयुक्त हैं. एक विदारक माइक्रोस्कोप, और संदंश का उपयोग कर के अंतर्गत, अन्य जोड़ी (चित्रा 1 बी) के साथ दूर जर्दी खींच जबकि संदंश की एक जोड़ी के साथ सिर सुरक्षित. वैकल्पिक रूप से, धीरे जर्दी दूर खींचने के लिए एक कीट पिन धारक में एक कीट पिन का उपयोग करें. भ्रूण पोकर का प्रयोग जर्दी मलबे (आंकड़े 1 सी डी) का एक बहुत कुछ नहीं है कि पेट्री डिश के एक हिस्से के लिए भ्रूण को स्थानांतरित (मछली पकड़ने की रेखा (0.41 मिमी व्यास) एक केशिका ट्यूब या एक पाश्चर विंदुक या तो से चिपके). एक गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग, संभव, और जी के रूप में कम तरल में भ्रूण महाप्राणently एक स्लाइड (चित्रा 1E) पर उन्हें विंदुक. धीरे एक प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग अतिरिक्त तरल दूर बाती. भ्रूण के साथ संपर्क से बचें. भ्रूण को बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ें. फ्लोरोसेंट लेबल के लिए, पसंद का एक antifade अभिकर्मक का उपयोग करें. वर्णमिति संकेतों के लिए, 70% ग्लिसरॉल एक बढ़ते माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. भ्रूण पोकर का प्रयोग, पंक्तियों (चित्रा 1F) में अपने पक्ष पर भ्रूण पूरबी. एक coverslip (चित्रा 1G) के प्रत्येक कोने में पेट्रोलियम जेली या उच्च वैक्यूम तेल में से एक "थपका" जोड़ें. यह अत्यधिक संपीड़न से भ्रूण के नुकसान से बचाता है. भ्रूण (चित्रा 1H) के शीर्ष पर coverslip (नीचे पेट्रोलियम जेली की ओर) रखें. धीरे (70% ग्लिसरॉल या विरोधी फीका बढ़ते अभिकर्मक) coverslip (चित्रा 1H) को छू रहा है बढ़ते मीडिया तक प्रत्येक कोने पर coverslip नल. यदि आवश्यक हो, सही अगले cov करने pipetting द्वारा अधिक बढ़ते मीडिया जोड़erslip, 20-200 मिलीग्राम की सीमा में एक pipettor का उपयोग. इसके तहत बाती जाएगा. एक प्रयोगशाला का उपयोग coverslip के आसपास पूरी तरह से साफ पोंछे. इस भ्रूण को नुकसान होगा ही, coverslip करने के लिए दबाव लागू नहीं करने के लिए कुछ खास होगा. इस क्षेत्र सूखी हो और उस पर कोई पेट्रोलियम जेली या बढ़ते मीडिया होना चाहिए. Coverslip (चित्रा 1 मैं) के किनारे के आसपास सील करने के लिए नेल पॉलिश का प्रयोग करें.

Representative Results

ऐसे सेलुलर patterning, भेदभाव, और अक्षतंतु मार्गदर्शन के रूप में विभिन्न विकासात्मक घटनाओं आबाद तंत्र है कि elucidating है, यह उनके ऊतक के संदर्भ में कोशिकाओं कल्पना करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है. पैक्स, nkx, या DBX परिवारों 4 में प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति डोमेन में एक उदर या पृष्ठीय बदलाव के रूप में आम तौर पर उपस्थित dorsoventral patterning दोष. समय में, परिवर्तन केवल कुछ सेल व्यास 4, जिसमें सूक्ष्म हो सकता है. क्रॉस अनुभागीय विश्लेषण विश्लेषण के इस प्रकार के परमिट. हालांकि, कमजोर संकेतों, या एपी अक्ष को सीधा नहीं कर रहे हैं कि पार वर्गों के साथ अभिकर्मकों व्याख्या सीमित कर सकते हैं. इसके अलावा, क्रॉस अनुभागीय विश्लेषण आसानी से परिवर्तन एपी अक्ष में जारी रहती है कि क्या खाते में लेने, और एक cryostat की उपलब्धता पर निर्भर करता है नहीं है. इस सीमा रीढ़ की हड्डी का पार्श्व दृश्य से उन्हें धोखा दिया है. चित्रा 2B में देखा, nkx6.1 mRNA घ हैपूर्वज डोमेन के भीतर, 24 घंटा बाद निषेचन (HPF) में रीढ़ की हड्डी के मोटे तौर पर उदर छमाही में istributed. पूर्वज कोशिकाओं रीढ़ की हड्डी की औसत दर्जे का भाग में पाया जाता है, जो मंजिल की थाली, की उपस्थिति के कारण पद mitotic कोशिकाओं से अलग पहचाना जाता है. डीआईसी प्रकाशिकी के साथ देखा, व्यक्ति की कोशिकाओं स्पष्ट रूप से अलग पहचाना जाता है, और कोशिकाओं को व्यक्त और nonexpressing के बीच एक परिभाषित सीमा स्पष्ट है. पूर्वज सेल चक्र से बाहर निकलने के जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के साथ है. उदाहरण के लिए, सभी के बाद mitotic न्यूरॉन्स immunocytochemistry 1,5 साथ detectable है जो Huc / डी व्यक्त करते हैं. आइलेट, Gata, और VSX परिवारों के लिए mRNA जांच प्रत्येक रीढ़ की हड्डी hemisegment 6 भीतर लगातार स्थिति और संख्या के विशिष्ट बाद mitotic न्यूरॉन्स लेबल. इसके अलावा, इस तरह के रोबो परिवार में उन लोगों के रूप अक्षतंतु मार्गदर्शन रिसेप्टर्स postmitotic न्यूरॉन्स की प्रतिबंधित आबादी में (चित्रा -2) व्यक्त कर रहे हैं <sup> 2,7,8. भ्रूण के पार्श्व बढ़ते बाद mitotic न्यूरॉन्स की सही मायने रखता है की अनुमति देता है. इसी तरह, विभाजित करने के लिए जारी है कि पूर्वज विरोधी phospho-histone 3 immunocytochemistry के साथ ही BrdU लेबलिंग के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इसके अलावा, कोशिका मृत्यु TUNEL लेबलिंग 4-6 के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है. 24 HPF पर निम्न postmitotic न्यूरॉन्स के axons विभिन्न तरीकों के साथ कल्पना, और एकल कोशिका के स्तर पर अलग पहचाना जा सकता है: पृष्ठीय पार्श्व आरोही (डोला), जोड़ संबंधी प्राथमिक आरोही (कोपा), जोड़ संबंधी माध्यमिक आरोही (कोसा), उदर अनुदैर्ध्य अवरोही (वेल्ड), Kolmer-Agdur (का), जोड़ संबंधी bifurcating / अनुदैर्ध्य (सिल / एल), परिधीय आरोही (सीआईए), परिधीय अवरोही (सीआईडी), और एकध्रुवीय जोड़ संबंधी अवरोही (UCoD), Rohon-दाढ़ी (आरबी), motoneurons ( एम) 9. Axons पृष्ठीय, उदर, पूर्वकाल, और पीछे दिशाओं में इन न्यूरॉन्स से करता हूं. वे शाखा, पृष्ठीय दोनों midline पार, और बाहर निकलेंऔर उदर रीढ़ की हड्डी. लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के साथ युग्मित, इन विभिन्न सेलुलर व्यवहार immunocytochemistry और ऐसे GFP 2 के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग, laterally घुड़सवार भ्रूण में स्पष्ट कर रहे हैं. चित्रा 2 डी में, znp -1 immunocytochemistry विकासशील motoneurons लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Motoneurons आसपास विकासशील मांसलता अंदर आना करने के लिए पेट के बल रीढ़ की हड्डी से बाहर निकलें. चित्रा 1. विच्छेदन और zebrafish भ्रूण के माउंट पार्श्व. (ए) immunofluorescence के लिए प्रसंस्करण के बाद, सीटू संकरण, आदि में, भ्रूण एक 35 मिमी पेट्री (0.5% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस) पीबीटी से भरा पकवान या PTW (पीबीएस के साथ में रखा जाता है 0.1% बीच 20). जर्दीगेंद (वाई बी) स्पष्ट है. (बी) की जर्दी सावधान विच्छेदन द्वारा पीछा भ्रूण का सिर प्राप्त करके निकाल दिया जाता है. (ग) एक भ्रूण पोकर (मछली पकड़ने की रेखा एक पाश्चर पिपेट से चिपके) अलग भ्रूण और जर्दी मलबे (डी) के लिए प्रयोग किया जाता है. साफ भ्रूण एक खुर्दबीन स्लाइड (ई) पर pipetted और (च) से जुड़ रहे हैं. (जी) पेट्रोलियम जेली coverslip के कोनों के लिए लागू किया जाता है. (एच) coverslip बढ़ते मध्यम में भ्रूण के शीर्ष पर धीरे रखा गया है. (मैं) नेल पॉलिश coverslip के किनारों को सील करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें . < मजबूत> चित्रा 2. में pathfinding जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और अक्षतंतु का विश्लेषण laterally zebrafish भ्रूण मुहिम शुरू की. 24 HPF पर एक zebrafish भ्रूण की (ए) आकर्षित. बी.डी. में, जर्दी थैली विस्तार से ऊपर मोटे तौर पर चार hemisegments (बॉक्सिंग क्षेत्र) कल्पना कर रहे हैं. (बी) nkx6.1 मंजिल की थाली (एफपी) सहित उदर रीढ़ की हड्डी में व्यक्त किया जाता है. (सी) robo3 postmitotic न्यूरॉन्स (PMN) में व्यक्त किया है. मंजिल की थाली और पूर्वज क्षेत्र में यह और अधिक पार्श्व फोकल हवाई जहाज़ में स्पष्ट नहीं है. बी, सी, रीढ़ की हड्डी की छवि के बाएं हाथ की ओर एक वर्ग से घिरा है. (डी) Confocal माइक्रोस्कोपी औदरीयता रीढ़ की हड्डी बाहर निकलने मोटर axons लेबल जो छवि znp -1 immunofluorescence, करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. सभी छवियों में, पूर्वकाल छोड़ दिया है और पृष्ठीय ऊपर है. एक 40x लंबी दूरी काम, पानी विसर्जन (एनए 0.8) लेंस (3.3 मिमी) का इस्तेमाल किया गया था.oad/50703/50703fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

रीढ़ की हड्डी में विकास के निर्धारित zebrafish भ्रूण एड्स दृश्य के पार्श्व बढ़ते. जर्दी गेंद को हटाने के माध्यम से, असाधारण सूक्ष्म इमेजिंग के लिए आवश्यक काम दूरी कम हो जाता है. पहले भ्रूण के कारण भ्रूण का आकार और ऊतकों की कमजोरी को काटना अधिक मुश्किल कर रहे हैं, हालांकि हमारे प्रतिनिधि परिणाम बहरहाल, इस तकनीक के रूप में जल्दी 18 HPF के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, 24 HPF मंच तक ही सीमित थे. इस तकनीक को भी 24 HPF से अधिक पुराने भ्रूण के लिए लागू है. भ्रूण zebrafish के ऑप्टिकल स्पष्टता, जेनेटिक्स, रिवर्स आगे आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता है, और ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण द्वारा सहायता प्राप्त, कई विकास की प्रक्रिया की जांच की जा सकती है. इस BrdU और विरोधी phospho-histone ^{4-6 मार्च} और पैक्स, nkx, DBX, और olig Familie में neuronal और glial पूर्वज मार्करों की अभिव्यक्ति के माध्यम से patterning तरह मार्कर के साथ neuronal progenitors के mitotic सूचकांक में शामिलएस ^{1,4-6. 1,4,5,10} इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे glial fibrillary एसिड प्रोटीन (GFAP) और Huc / डी के रूप में) glial और neuronal दृढ़ संकल्प है कि रिपोर्ट अभिकर्मकों. Neuronal उप प्रकार भेदभाव आइलेट, VSX, engrailed, और Gata जीन ^1,4-6 की अभिव्यक्ति के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है. और अंत में, अक्षतंतु मार्गदर्शन के विश्लेषण में इस तरह के विरोधी acetylated ट्यूबिलिन, 3A10, और znp -1 ^2,11,12 के रूप में एंटीबॉडी के माध्यम से संभव है. अन्य हड्डीवाला मॉडल प्रणाली (माउस और लड़की) बरकरार भ्रूण में सभी विकास कुल्हाड़ियों से ही zebrafish परमिट एक साथ देखने, रीढ़ की हड्डी के विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं.

इस दृष्टिकोण को स्पष्ट सीमा रहते इमेजिंग precludes, जो भ्रूण तय कर रहे हैं कि है. वास्तव में, तेजी से भ्रूण मौत में जर्दी परिणाम (या नुकसान) को हटाने, इस प्रकार यह इस तकनीक का उपयोग रहते भ्रूण में काम दूरी को कम करना संभव नहीं है. बहरहाल, उच्च बढ़ाई रीढ़ की सहलाइव भ्रूण में आर डी इमेजिंग संभव है. लाइव इमेजिंग के दौरान जर्दी बनाए रखने के लिए, भ्रूण नमूना और coverslip के बीच एक बड़ा स्थान प्रदान करते हैं जो अवसाद स्लाइड्स, में रखा जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, कई 22 मिमी x 22 मिमी coverslips सूक्ष्म स्लाइड में एक्स 1 में 3 की या तो स्लाइड पर चिपके जा सकता है. coverslips overlying coverslip के लिए एक "पुल" के रूप में सेवा करते हैं. भ्रूण 18 HPF से अधिक उम्र के हैं, तो tricaine आंदोलन को रोकने के लिए भ्रूण anesthetize के लिए प्रयोग किया जाता है. बरकरार जर्दी के साथ, agarose में एम्बेडेड लाइव भ्रूण के साथ कार्य करते समय 0.288 मिमी की दूरी काम, 24 HPF पर deyolked भ्रूण के लिए आवश्यक है, जबकि 3.3 मिमी की दूरी काम के साथ एक सूक्ष्म लेंस के लिए पर्याप्त है. वैकल्पिक रूप से, deyolked भ्रूण से ली गई explant संस्कृतियों एक प्लाज्मा थक्का स्थिरीकरण तकनीक ¹³ का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं. कोशिकाओं के विभिन्न आबादी ऐसी GFP, mCherry, या photocon के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग के माध्यम से देखा जा सकता हैvertible डाई Kaede (कुछ नाम हैं). इसके अलावा, chimeric भ्रूण भीतर fluorescently लेबल कोशिकाओं को भी इस दृष्टिकोण ¹⁴ के साथ देखा जा सकता है.

महीने के लिए स्थिर है कि लगातार बढ़ते तकनीक विकास और कोशिका जीव के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इस सरल तकनीक विभिन्न प्रायोगिक परीक्षणों के बीच आसान तुलना की अनुमति, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. इसके अलावा, पंक्तियों में भ्रूण के संरेखण तत्काल बाद में विश्लेषण के लिए विशिष्ट भ्रूण की पहचान परमिट.

Materials

Petri dishes 35mm X 10mm	VWR	25373-041
Dumont Forceps #3	Fisher Scientific	NC9839169
Cover glass	Fisher Scientific	12-541-B22X22-1.5
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
SlowFade Gold	Fisher Scientific	S36936
ProLong Gold	Life Technologies	P36934
Petroleum Jelly	Any grocery store
Loop Holders	VWR	80094-482
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10
Nickel Plated Pin Holders	Fine Science Tools	26016-12

Name of Equipment	Company	Catalog number
Olympus Stereo microscope	Olympus	SZ61