Udviklingsmæssige processer, såsom spredning, mønster, differentiering og Axon vejledning kan let modelleres i zebrafisk rygmarven. I denne artikel beskriver vi et monterings procedure for zebrafisk embryoner, der optimerer visualiseringen af disse begivenheder.
Zebrafisk rygmarven er en effektiv undersøgende model for nervesystemet forskningen af flere grunde. For det første kan genetiske, transgene og gen knockdown tilgange udnyttes til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger nervesystem udvikling. For det andet, store kløer udviklingshæmmede synkroniserede embryoner giver store eksperimentelle stikprøvestørrelser. For det tredje, den optiske klarhed af zebrafisk foster tillader forskerne at visualisere stamfader, glial og neuronale populationer. Selvom zebrafisk embryoner er gennemsigtige, kan prøven tykkelse hæmme den effektive mikroskopisk visualisering. En årsag til dette er tandem udviklingen af rygmarven og overliggende somit væv. En anden årsag er den store æggeblomme bolden, som stadig er til stede i perioder med tidlig neurogenese. I denne artikel vil vi demonstrere mikrodissektion og fjernelse af blommen i faste embryoner, der tillader mikroskopisk visualisering samtidig bevare omgivende somite væv. Vi also demonstrere halvpermanent montering af zebrafisk embryoner. Dette tillader observation af nervesystemets i dorso-ventrale og anterior-posterior akser, da den bevarer tredimensionalitet af vævet.
Visualisering af rygmarven i zebrafisk inhiberes af en række faktorer. På grund af tykkelsen af de overliggende somitter og den interne placering af rygmarven, er et betydeligt lang arbejdsdag afstand der kræves for høj cellulær opløsning. Blommesækken kugle (som stadig er til stede i de tidlige stadier af neurogenese) øger yderligere arbejdsafstanden kræves, og er let beskadiget af pres fra et dækglas. Desuden snavs fra beskadigede æggeblomme forbyder klar visualisering af væv. Selv er mulige tværsnit i dorso-ventral (DV)-akse, behøver de ikke umiddelbart tillade samtidig visualisering i anterior-posterior (AP) akse 1.
For at overvinde disse forhindringer, er embryoner dissekeres og monteret på dias. Denne procedure giver flere fordele. Først zebrafisk embryoner let ligge med den laterale side opad, hvilket letter AP akse visualisering. For det andet fjernelse af blommen ball nedsætter den krævede arbejdstid afstand, og begrænser snavs. Tredje denne montering procedure giver mulighed for både fluorescerende og lysfeltmikroskopi. For det fjerde, monterede embryoner er stabile i måneder ved 4 ° C, hvilket giver forlænget eksemplar visualisering. Endelig forekommer progression af udvikling på forreste segmenter er mere modne end bageste segmenter. For at sikre, at iscenesatte matchede spinal hemisegments sammenlignes mellem embryoner, der er overliggende somite væv, der anvendes som en vejledning. For eksempel tiende mest posteriore somite overlejrer den tiende spinal hemisegment, som er udviklingsmæssigt ækvivalent i fase-matchede embryoner. Denne montage procedure af intakte embryoner gør det nemt at identificere somitter.
Vi bruger genetik og gen knock-down teknologier til at studere mekanismerne i Axon vejledning i udviklingslandene rygmarven. Især har vi fastslået, at der er behov robo2, robo3 og DCC til kommissurale Primær ASCEnde (COPA) Axon stifinding. Brug af montage her beskrevne procedure, var vi i stand til at undersøge ventrale vækst, midterlinjen passage, commissure bredde, bryst og forreste vækst på 2,3. Denne montering procedure kan også anvendes til DV eller AP mønsterdannelse af rygmarven. Vi har brugt denne fremgangsmåde til at bestemme forskellige roller downstream Wnt effektorer i DV mønstret af rygmarven. Ved hjælp af denne montering, var vi i stand til at opnå opløsning på DV markører på enkelt celle niveau, og bestemme minut mønstergivende forskydninger som følge af ændret Wnt signalmodtagelse 4,5. Denne montage fremgangsmåde giver også mulighed for mitotisk indeks beregning gennem anti-phosphohistone 3 eller BrdU mærkning (stamfader proliferation) differentiering 5..
Lateral montering af fast zebrafisk embryoner hjælpemidler visualisering af rygmarven udvikling. Gennem fjernelse af blommen bold, bliver arbejdsmiljøet afstand kræves for ekstraordinære mikroskopiske billeddannelse reduceret. Vores repræsentative resultater var begrænset til 24 HPF fase, dog kan denne teknik anvendes så tidligt som 18 HPF, selvom tidligere embryoer er vanskeligere at dissekere på grund af størrelsen af embryoet og skrøbelighed af vævet. Denne teknik er også gældende for embryoner ældre end 24 HPF. Ved hjælp af den optiske klarhed af den embryoniske zebrafisk, evnen til at udføre frem genetiske skærme, reverse genetik og transgene metoder kan flere udviklingsprocesser undersøges. Dette omfatter mitotiske indeks for neuronale forfædre med markører som BrdU og anti-fosfor histon marts 4-06 og mønster gennem udtryk af neuronale og gliale progenitor markører i pax, NKX, dbx, og olig Families 1,4-6. Reagenser, der indberetter glia og neuronal bestemmelse (såsom gliafibrillært syre protein (BiH) og HUC / D) 1,4,5,10 kan anvendes. Neuronal subtype differentiering kan analyseres gennem udtryk for holm, VSX, engrailed og gata gener 1,4-6. Og endelig analyse af axon vejledning er muligt gennem antistoffer, såsom anti-acetyleret tubulin, 3A10, og znp-1 2,11,12. Selvom andre hvirveldyr modelsystemer (mus og kylling) anvendes til at studere rygmarv udvikling kun zebrafisk tillader samtidig visning af alle udviklingsmæssige akser i intakte foster.
Den indlysende begrænsning til denne tilgang er, at embryonerne er faste, som udelukker direkte billedvisning. Faktisk fjernelse af (eller beskadigelse) æggeblomme resulterer i hurtig fosterdød, hvorfor det ikke er muligt at reducere distancen i levende embryoer ved hjælp af denne teknik. Men høj forstørrelse spinal cord billeddannelse i levende fostre er mulig. For at bevare blommen under live billedbehandling kan embryoer placeres i depression dias, som giver et større mellemrum mellem prøven og dækglasset. Alternativt kan flere 22 mm x 22 mm dækglas limes på enten slide af en 3 i x 1 i mikroskopiske dias. Dækglassene tjene som en "bro" til overliggende dækglas. Hvis embryoner er ældre end 18 HPF er tricaine bruges til at bedøve embryoner at forhindre bevægelse. Mens en arbejdsgruppe afstand på 0.288 mm er nødvendig for deyolked embryoner ved 24 HPF, når man arbejder med levende fostre indlejret i agarose, med intakte æggeblommer, en mikroskopisk linse med en arbejdsgruppe afstand på 3,3 mm er tilstrækkelig. Alternativt kan eksplantatkulturer stammer fra deyolked embryoner visualiseres ved hjælp af et plasma blodprop immobilisering teknik 13.. Forskellige populationer af celler kan observeres ved anvendelse af genetisk indkodede fluorescerende proteiner, såsom GFP, mCherry eller photoconkonvertible farvestof Kaede (for at nævne nogle få). Endvidere kan fluorescens-mærkede celler i kimære embryoner også ses med denne tilgang 14.
En konsekvent montage teknik, der er stabilt i flere måneder er et kritisk værktøj til udviklings-og cellebiologer. Denne enkle teknik er reproducerbar, hvilket giver nem sammenligning mellem forskellige eksperimentelle forsøg. Desuden tilpasningen af embryoner i rækkerne umiddelbart muliggør identifikation af specifikke embryoner til senere analyse.
The authors have nothing to disclose.
Skidmore Faculty Development Grant finansieret udarbejdelse og offentliggørelse af dette manuskript.
Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
Petroleum Jelly |
Any grocery store |
|
Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
|
Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |