O tecido adiposo (TA) é um site de ativação imune celular intensa e interação. Quase todas as células do sistema imune estão presentes em AT e as suas proporções são alteradas pela obesidade. Isolamento adequado, quantificação e caracterização de populações de células imunes são fundamentais para a compreensão do seu papel na doença immunometabolic.
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Artigo de método
Isolamento de tecido adiposo de células imunes
Neste artigo
Resumo
Resumo
A descoberta de aumento de infiltração de macrófagos no tecido adiposo (TA) de roedores obesos e humanos conduziu a um interesse em intensificação da contribuição de células imunes à resistência à insulina local e sistémica. O isolamento e quantificação de populações de células imunitárias diferentes nos magros e obesos AT é agora uma técnica vulgarmente utilizada em laboratórios immunometabolism; Ainda extremo cuidado deve ser feita tanto no isolamento das células vasculares do estroma e na análise de citometria de fluxo, de modo que os dados obtidos são fiáveis e podem ser interpretados . Neste vídeo demonstramos como picar, digerir, e isolar a fração de células enriquecido estroma vascular imunológico. Posteriormente, vamos mostrar como anticorpos rótulo macrófagos e linfócitos T e como fazer corretamente portão los em experimentos de citometria de fluxo. Representante de citometria de fluxo de parcelas provenientes de gordura alimentados com ratos obesos alimentados com gordura de baixa magra e alta são fornecidos. Um elemento crítico da presente análise é o uso de anticorpos que fazemnão fluorescência nos canais onde a AT macrófagos são naturalmente autofluorescent, bem como o uso de controles de compensação adequados.
Introdução
Historicamente, o tecido adiposo (TA) tem sido visto como um órgão inerte de armazenamento de lípidos, a qual expande e contrai em resposta ao equilíbrio de energia. Agora entendemos que a AT representa um órgão endócrino dinâmico que secreta ativamente uma série de hormônios que influenciam diretamente no comportamento alimentar e homeostase da glicose sistêmica. Além disso, durante a última década tem havido uma apreciação crescente para as numerosas populações de células do sistema imunológico que residem na fracção vascular do estroma EM (SVF), bem como a sua contribuição para a AT homeostase.
A capacidade para separar o EM adipócito ....
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Protocolo
1. Reagentes e Suprimentos
Antes de se iniciar este protocolo experimental, preparar os seguintes reagentes:
- 70% de etanol
- PBS 1X
- 1X DPBS (sem Ca e Mg), suplementado com 0,5% de BSA
- FACS buffer: 1X DPBS (sem Ca e Mg), EDTA 2 mM, e 1% de FCS
- ACK tampão: 150 mM de NH4Cl, 10 mM KHCO 3, e 0,1 mM Na 2 EDTA em água
2. A colheita e preparação do tecido adiposo
- Eutanásia camundongos de acordo com os procedimentos aprovados pela IACUC específicos de cada instituição.
- Molhe cuidadosamente a pele com álcool 70%.....
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Resultados
A colagenase seguido de digestão de EM por centrifugação diferencial foi usado para isolar o SVF de almofadas de gordura epididimal de ratos C57BL/6J machos alimentados com baixo teor de gordura (10% kcal de gordura) ou rica em gorduras (60% kcal de gordura), dieta (LFD e HFD , respectivamente) durante 16 semanas. Células do SVF foram então marcadas com anticorpos primários fluoróforos para quantificar a percentagem de ATMs viável (Figura 1) e AT células T (Figura 2) através de análise .......
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Discussão
O interesse crescente no papel do sistema imunológico nas consequências metabólicas da obesidade levou à utilização generalizada de citometria de fluxo para caracterizar as células imunes do TA. Embora o protocolo exacto irá variar entre laboratórios com base na sua experiência e equipamentos disponíveis, os passos críticos incluem digestão com colagenase, a centrifugação diferencial, e o antigénio da superfície da célula de rotulagem. O objetivo do presente artigo é fornecer um protocolo detalhado e guia prático para o.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
JSO é apoiado por um NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH é apoiado por um Heart Association Award americano Investigator Fundada (12EIA8270000). Experimentos de citometria de fluxo foram realizadas no VMC Citometria de Fluxo de Recursos Compartilhados. O VMC Citometria de Fluxo de recursos partilhada é apoiado pelo Digestive Disease Research Center Vanderbilt (DK058404).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DPBS (sem Ca ou Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| colagenase | Sigma | C6885-5G | |
| solução de iodeto de propídio | Sigma | P4864-10 ml | |
| pilha estável 20 microlitros | Rainin | Pontas de filtro SS-L10 | |
| Pontas de filtro de 250 microlitros de pilha estável | Rainin | SRL10F | |
| Pontas de filtro de 1000 microlitros | Rainin | GPS-L1000 | |
| BD Biosciences | 553142 | ||
| filtros fisher 100mn | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| prato de pesagem média | Fisherbrand | 02-202B | |
| folha de alumínio | Fisherbrand | 1213100 | |
| tesoura de picar | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| Tubos cônicos de 50 ml | BD Falcon | 14-959-49A | |
| tubos FACS com filtro superior BD | Falcon | 352235 | |
| estojo de pipeta de 10 ml 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| tubos de fundo redondo | BD Falcon | 352058 | |
| seringa de 5 ml | BD Falcon | 309646 | |
| V Placas inferiores | Costar | 07-200-107 | |
| pipeta de bulbo de transferência | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Tapete adesivo | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Centrífuga de cultura de células | Sorvall | 75253839 | |
| Adaptadores | Sorvall | 75003723 | |
| Rato anti-rato CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentração: 0,5 - 1 μ g/ 106 |
| células Rato anti-rato F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Conjugado de fluoróforo: APC Concentração: 0,2 μ g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: 17-4321 |
| Rato anti-rato CD11b | eBioscience | 11-0112 | Conjugado de fluoróforo: FITC Concentração: 0,5 μ g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: 11/1/4031 |
| Hamster armênio anti-camundongo CD11c | eBioscience | 12-0114 | Conjugado de fluoróforo: PE Concentração: 0,8 μ g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R& D Systems | FAB4297P | Conjugado de fluoróforo: PE Concentração: 0,1 μ g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: IC108P |
| Cabra anti-rato CD206 | R& D Systems | FAB2535P | Conjugado de fluoróforo: PE Concentração: 0,1 μ g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R& D Systems | FAB5538P | Conjugado de fluoróforo: PE Concentração: 0,1 μ g/ 106 células Número de catálogo do controle de isotipo: IC013P |
| Hamster armênio anti-rato TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Conjugado de fluoróforo: APC Concentração: 0,2 μ g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: 553956 |
| Rato anti-camundongo CD8a | BD Biosciences | 552877 | Conjugado de fluoróforo: PE-Cy7 Concentração: 0,8 μ g/ 106 células Número de catálogo de controle de isotipo: 552784 |
| Rato anti-camundongo CD4 | BD Biosciences | 557956 | Conjugado de fluoróforo: Alexa Fluor 700 Concentração: 0,2 μ g/ 106 células Número de catálogo do controle do isotipo: 557963 |
Tabela 1. Lista de Materiais e Reagentes. |
Referências
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-ind....
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Reimpressões e permissões
