Fettvev (AT) er et område med intens immun celle aktivering og interaksjon. Nesten alle celler i immunsystemet er tilstede i AT og deres forhold er endret av fedme. Riktig isolasjon, kvantifisering, og karakterisering av AT immun celle populasjoner er avgjørende for å forstå sin rolle i immunometabolic sykdom.
Oppdagelsen av økt makrofaginfiltrering i fettvev (AT) av overvektige gnagere og mennesker har ført til en intensivering av interesse i immunceller bidrag til lokal og systemisk insulinresistens. Isolering og kvantifisering av ulike immun celle populasjoner i mager og obese AT er nå en vanligvis benyttes teknikk i immunometabolism laboratorier, men ekstrem forsiktighet må tas både i stromal vaskulær celle isolasjon og i flowcytometri analyse, slik at data innhentet er pålitelig og tolkbare . I denne videoen viser vi hvordan du kjøttdeig, fordøye, og isolere immun celle-beriket stromal vaskulær brøk. Deretter viser vi hvordan du antistoff label makrofager og T-lymfocytter og hvordan du riktig gate på dem i flowcytometri eksperimenter. Representative flowcytometri plott fra lave fett-matet mager og høy fett-matet overvektige mus er gitt. Et kritisk element i denne analysen er bruk av antistoffer som gjørikke fluoresce i kanaler der AT makrofager er naturlig autofluorescent, samt bruk av riktig kompensasjon kontroller.
Historisk har fettvev (AT) blitt sett på som en inert organ av lipid lagring, noe som utvider seg og trekker i respons til energibalansen. Nå forstår vi at AT representerer et dynamisk endokrine organ som aktivt utskiller en rekke hormoner, som direkte påvirker spiseatferd og systemisk glukose homeostase. I tillegg, det siste tiåret har det vært en økende forståelse for de mange bestander av immunceller bosatt i AT stromal vaskulær fraksjon (SVF), samt deres bidrag til AT homeostase.
Evnen til å skille AT adipocyte og SVF bruker en collagenase fordøye etterfulgt av differensial sentrifugering ble først beskrevet av Rodbell i 1964 en. Collagenase II er oftest brukt for adipocyte og SVF separasjon på grunn av vedlikehold av adipocyte insulin reseptorer en. Tidlig på, enzymatisk fraksjonering av AT ble primært brukt til å studere adipocyte metabolismen og å isolere preadipocytes. Mer nylig har denne teknikken, kombinert med den utbredte tilgjengeligheten av flowcytometere og den stadig økende antall kommersielt tilgjengelige fluorophore-konjugerte antistoffer, til rette for karakterisering av AT immunceller.
Selv om tilstedeværelsen av immunceller i betent på hadde vært beskrevet tidligere 2, seminal artikler av Weisberg, et al. og Xu et al. publisert i 2003 var de første til å dokumentere opphopning av AT makrofager (minibanker) i fedme, som skiller inflammatoriske cytokiner og korrelerer med AT-spesifikke og systemisk insulinresistens 3,4. Disse observasjonene tjente som grunnlag for et nytt felt med etterforskning nylig innførte, "immunometabolism," 5 og har blitt fulgt opp av studier implicating ulike immun celle populasjoner, inkludert dendrittiske celler 6, mastceller 7, T-celler 8 –10, B-celler 11, NKT celler 12, eosinofile 13, og nøytrofile 14,15 i utviklingen av fedme assosiert insulinresistens.
Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert beskrivelse av collagenase fordøye teknikk som brukes for å isolere celler av AT SVF og å karakterisere minibanker og ved T-celler via flow cytometri. Denne protokollen er optimalisert for mus AT, men kan seerne nytte av å lese en utmerket artikkel som gir omfattende detalj på optimalisering av denne teknikken for menneskelig AT 16. Målgruppen for denne artikkelen omfatter etterforskere med begrenset erfaring med musen AT og utføre flowcytometri. Flere praktiske hensyn for å balansere mobilnettet yield og levedyktighet med tid og ressurser blir presentert samt optimale flowcytometri kontroller for å karakterisere AT immun celle populasjoner. I tillegg til protokollen vår, leserne er referred en fersk Jove artikkel av Basu et al. for en utmerket diskusjon av noen av de tekniske aspektene ved flowcytometri å inkludere forsvarlig kontroll og kompensasjoner 17.
Økende interesse for rollen av immunsystemet i de metabolske konsekvensene av fedme har ført til utbredt bruk av flowcytometri å karakterisere immunceller i AT. Selv om den eksakte protokollen vil variere mellom laboratorier basert på egen erfaring og tilgjengelig utstyr, de kritiske trinnene omfatter collagenase fordøyelsen, differensial sentrifugering, og celleoverflateantigen merking. Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert protokoll og praktisk guide for isolering av AT SVF til etterforskere med begre…
The authors have nothing to disclose.
JSO er støttet av en NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), er AK støttet av en postdoktorstilling fra American Diabetes Association (7-10-MI-05), og AHH er støttet av en American Heart Association Etablert Investigator Award (12EIA8270000). Flowcytometri eksperimenter ble utført i VMC flowcytometrisystemer delt ressurs. VMC flowcytometrisystemer delt ressurs støttes av Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Name | Company | Catalog # | |
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
DAPI | Life Technologies | D3571 | |
BSA | Sigma | A2153-100G | |
collagenase | Sigma | C6885-5G | |
propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
Adapters | Sorvall | 75003723 | |
Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.