Изоляция жировой ткани иммунных клеток
Summary
Жировая ткань (AT) является объектом интенсивных активации иммунной клетки и взаимодействия. Почти все клетки иммунной системы, которые присутствуют в AT и их отношения меняются от ожирения. Правильная изоляция, количественное определение и характеристика AT иммунные клеточные популяции имеют решающее значение для понимания их роли в immunometabolic заболевания.
Abstract
Открытие увеличился инфильтрации макрофагов в жировой ткани (AT), страдающих ожирением грызунов и человека привело к усилению интереса к иммунной клетке вклад местных и системных резистентность к инсулину. Выделение и количественная оценка различных иммунных клеточных популяций в худых и тучных AT сейчас обычно используются в технике immunometabolism лабораториях, однако особую осторожность должны быть приняты как в стромальных сосудистой изоляторе и в анализе проточной цитометрии, так что полученные данные надежно и интерпретируемых . В этом видео мы покажем, как фарш, переварить, и изолировать иммунных клеток обогащенного стромальных сосудистой фракции. Впоследствии мы покажем, как антитела этикетке макрофагов и Т-лимфоцитов, и как правильно на них ворота в экспериментах проточной цитометрии. Представитель проточной цитометрии участков из низким содержанием жира и мяса и кормили с высоким содержанием жиров кормили мышей ожирением предоставляются. Важнейшим элементом этого анализа является использование антител, которые делаютне флуоресцирует в каналы, где AT макрофаги естественно аутофлуоресцентной, а также использование надлежащего контроля компенсации.
Introduction
Исторически сложилось, что жировая ткань (AT), рассматривается в качестве инертного орган накопления липидов, который расширяется и сжимается в зависимости от энергетического баланса. Теперь мы понимаем, что AT представляет собой динамическое эндокринный орган, активно выделяет ряд гормонов, которые непосредственно влияют на пищевое поведение и системного гомеостаза глюкозы. Кроме того, в течение последнего десятилетия наблюдается увеличение признательность за многочисленные популяции иммунных клеток, проживающих в AT стромальных сосудистой фракции (НВФ), а также их вклад в AT гомеостаза.
Возможность отделить AT адипоцитов и СФДВ использованием коллагеназы дайджест последующим дифференциальным центрифугированием был впервые описан в 1964 году Родбелл 1. Коллагеназа II чаще всего используется для адипоцитов и SVF разделения за счет поддержания адипоцитов рецепторы инсулина 1. Уже на раннем этапе ферментативного фракционирования AT в основном используются для изучения ADIPOцит метаболизма и изолировать преадипоцитов. Совсем недавно, этот метод, в сочетании с широкой доступности потока цитометрах и постоянно растущего количества коммерчески доступных флуорофором антителами, способствовала характеристика AT иммунных клеток.
Хотя присутствие иммунных клеток в воспаленных AT было описано ранее 2, семенных работ Weisberg соавт. Сюй и др.. опубликованной в 2003 г. первым документом накопления AT макрофагов (ATM) в ожирение, которые секретируют цитокины и коррелируют с AT-специфический и системной инсулинорезистентности 3,4. Эти наблюдения послужили основой новой области исследования недавно придумали, "immunometabolism", 5 и были последовать исследования причастности различных иммунных клеточных популяций, в том числе 6 дендритных клеток, тучных клеток 7, 8 Т-клетки –10, В-клетки 11, 12 NKT клетки, эозинофилы 13, 14,15 и нейтрофилов в развитии ожирения связана резистентность к инсулину.
Цель этой статьи заключается в предоставлении подробное описание техники коллагеназе дайджест использованы для выделения клетками AT SVF и охарактеризовать атм и Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Этот протокол был оптимизирован для мыши AT, однако зрители могут извлечь пользу из чтения отличную статью, предусматривающую подробностях по оптимизации этой техники для человека в 16 лет. Целевая аудитория этой статьи содержится следователей с ограниченным опытом работы с мышью и выполнение проточной цитометрии. Несколько практических соображений для балансировки сотовой урожайности и жизнеспособности со временем и ресурсами представлены, а также оптимальных управлений проточной цитометрии для характеристики AT иммунных клеточных популяций. В дополнение к нашему протоколу, читатели referrED В недавней статье на Юпитер Басу и др.. для отличной обсуждение некоторых технических аспектов проточной цитометрии включить надлежащего контроля и компенсаций 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Растущий интерес к роли иммунной системы в метаболических последствий ожирения привело к широкому использованию проточной цитометрии, чтобы охарактеризовать иммунные клетки АТ. Хотя точный протокол будет варьироваться между лабораториями на основе их собственного опыта и имеющего?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JSO поддерживается NIH Рут Л. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), А. К. поддерживается Докторантура стипендий от Американской Диабетической Ассоциации (7-10-МИ-05), а АНН поддерживается Американской кардиологической ассоциации, созданной Награда Исследователя (12EIA8270000). Эксперименты проточной цитометрии проводили в проточной цитометрии VMC общему ресурсу. VMC проточной цитометрии общий ресурс поддерживается пищеварительной Вандербильта Болезнь научно-исследовательский центр (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
Referências
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
