Totalt Protein Extraction og 2-D-gel-elektroforese Metoder<em> Burkholderia</em> Arter

Summary

Medlemmer av Burkholderia slekten er patogener av klinisk betydning. Vi beskriver en fremgangsmåte for total bakterieprotein utvinning, ved hjelp av mekaniske forstyrrelser, og 2-D-gel-elektroforese etterfølgende proteomikk analyse.

Abstract

Undersøkelsen av de intracellulære protein-nivåer i bakterielle arter er av betydning for å forstå de patogene mekanismer av sykdommer forårsaket av slike organismer. Her beskriver vi en fremgangsmåte for protein-fjerning fra Burkholderia arter basert på mekanisk lysis ved hjelp av glasskuler i nærvær av etylendiamin-tetraeddiksyre og fenylmethyl-sulfonylfluorid i fosfatbufret saltvann. Denne metoden kan bli brukt for forskjellige Burkholderia arter, for forskjellige vekstbetingelser, og det er sannsynlig egnet for bruk i proteomic studier av andre bakterier. Etter protein ekstraksjon, er en to-dimensjonal (2-D) gelelektroforese proteomikk teknikk som er beskrevet for å studere globale endringer i proteomes av disse organismene. Denne metoden består av separering av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimensjon, etterfulgt av separering på basis av molekylvektved akrylamid gel elektroforese i den andre dimensjonen. Visualisering av separerte proteinene blir utført ved sølvfarging.

Introduction

Slekten Burkholderia omfatter mer enn 62 arter, Gram-negative organismer ble isolert fra en rekke nisjer, og den er delt i to hoved klynger ^1,2. Den første klyngen omfatter mennesker, dyr og phytotrophic organismer, og de fleste studier har fokusert på de sykdomsfremkallende arter av denne gruppen på grunn av deres kliniske betydning. De mest patogene medlemmer er B. pseudomallei og B. mallei (som forårsaker melioidosis og glanders henholdsvis) ^3,4 og opportunistiske patogener (de 17 definerte arter av Burkholderia cepacia kompleks, BCC) ^5, som forårsaker sykdom hos cystisk fibrose (CF) og kronisk granulomatøs sykdom (CGD) ^en. Den andre klyngen, med mer enn 30 ikke-patogene arter, omfatter bakterier assosiert med planter eller med miljøet, og anses potensielt fordelaktig for verten ^2..

Tallrike komplikasjoner dukker frOM bakteriell infeksjon med den patogene medlemmer av Burkholderia slekten, slik som overføring av organismen mellom pasienter, spredning av sykdommen og behandlingssvikt på grunn av den indre eller ervervet resistens mot antibiotika gjør vanskelig å utrydde i de fleste av tilfellene ^6-9. Derfor få en klarere forståelse av grunnlaget for etablering av bakteriell infeksjon er viktig for behandling av sykdommer forårsaket av slike organismer. For å få innsikt i etablering av infeksjon, er omfattende undersøkelser på de bakterielle komponenter assosiert med patogenesen nødvendig. Studier som fokuserer på proteomikk analyser av Burkholderia organismer ved hjelp av proteomikk tilnærminger beskrevet proteiner som har vært innblandet i bakteriell patogenesen samt endringer i deres proteom profiler ^10-16.

Protein utvinning metoder ved hjelp av ultralydbehandling og fryse-tint sykluser i lysis buffer som inneholder høy konsentration av urea, har tiourinstoff i kombinasjon med vaskemiddel og ampholytes blitt anvendt i Burkholderia proteomikk studier ^10-13. Selv urinstoff er ganske effektiv for proteindenaturering, kan den etablere en likevekt i vandig oppløsning med ammonium-isocyanat, som kan reagere med amino-syregrupper, for derved å danne gjenstander (karbamylering reaksjon) ^17. Derfor anbefales det å inkludere bærer ampholytes, som fungerer som cyanat passiveringsmidler og unngå temperaturer høyere enn 37 ° C ^17. Videre, for å forhindre en hvilken som helst kjemisk interferens av lysis buffer med protein kvantifisering, den samme lyseringsbuffer kan anvendes til å generere standardkurven, slik at prøvene og standardene har samme bakgrunn ^10.. Andre metoder involverer bruken av alkaliske buffere og vaskemidler med varme inkubasjonsperioder ^17,18, men disse betingelser kan indusere endringer i proteomet og enkelte vaskemidler er ikke kompatible med proteomics søknad med mindre senere fjernings vaskemiddel trinn er inkludert ^17,18.

Etter tilfredsstillende ekstraksjon og kvantifisering kan global protein ekspresjon av hvert enkelt protein bli studert ved hjelp proteomic tilnærminger som to-dimensjonal (2-D) gelelektroforese. Denne teknikken ble først beskrevet av O'Farell ¹⁹ og består i separasjonen av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimensjon, og deretter i henhold til deres molekylvekt ved akrylamid gel elektroforese i den andre dimensjonen. På grunn av dets oppløsning og sensitivitet, er denne teknikken et kraftig verktøy for analyse og påvisning av proteiner fra komplekse biologiske kilder ^19,20. Denne separasjonsteknikk er for tiden tilgjengelig i protein-sentriske tilnærminger med den store fordelen av å løse protein isoforms forårsaket av post-transcriptional modifikasjoner eller proteolytisk prosessering. Kvantitative endringerkan påvises ved å sammenligne intensiteten av den tilsvarende sted etter farging av gelen ^20.. Imidlertid er denne teknikk ikke er egnet for identifisering av meget store proteiner, membranproteiner, ekstremt enkel og sure eller hydrofobe proteiner, og er en noe arbeidskrevende og tidskrevende teknikk ^20.. Nye peptid-sentriske tilnærminger (ikke gel-basert) som er mer robust og objektiv blir tilgjengelige og kan benyttes for kvantitativ sammenligning av differensial stabile isotoper for merking av metoder som cystein merking av isotop-kodet affinitet merking (ICAT) ^21, og aminogruppen merking av isotopen tagging for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) ^22. Bruken av en enkelt proteomikk teknikk kan gi utilstrekkelig informasjon, og derfor bruken av to komplementære proteomic tilnærminger er nødvendig for de fleste fullstendig å vurdere endringer i proteom. Ikke desto mindre er 2-D-gel-elektroforese utbredt og kan rutinemessig anvendes for kvantitative uttrykket av flere proteiner i ulike organismer.

Her beskriver vi en hel-celle protein utvinning og 2-D gel elektroforese prosedyrer for Burkholderia arter som ble tilpasset og optimalisert fra GE Healthcare 2-D elektroforese Prinsipper og metoder håndbok 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Proteinet ekstraksjon ble utført ved hjelp av en limstreng beater med glasskuler i nærvær av PBS inneholdende 5 mM EDTA (etylendiamin-tetraeddiksyre), 1 mM PMSF (fenylmethyl-sulfonylfluorid). Denne prosedyren tillater kvantifisering av proteiner med minimal degradering og er amendable for proteomikk tilnærminger som tidligere rapportert ^15,23,24. 2-D-gel-elektroforese ble utført ved å bruke 24 cm lang immobilisert pH 4-7 gradient og proteiner ble separert i henhold til deres isoelektriske punkt. Deretter proteiner ble separert i henhold til deres Molecmeringen vekt ved SDS-polyakrylamid-gel. I tillegg har vi beskrevet en sølvfargemetoden for visualisering av stikk proteiner, og en sølvfarge metode som er kompatibel for massespektrometri-analyse. Sammen disse prosedyrene kan tillate identifikasjon av viktige proteiner fra Burkholderia arter som kan være involvert i patogenesen.

Protocol

En. Kultur Vekst (Days 1 +2) Dyrk en startkultur: 3 ml Luria Bertani (LB) buljong i en smekk topp 15 ml tube, ved 37 ° C rotator over natten. Tynn ut over natten vekst til en OD 600 på 0,6. Tilsett 1 ml av denne fortynning til 100 ml LB-næringsløsning i en 250 ml Erlenmeyer kolbe. Inkuber ved 37 ° C med rysting ved 250 rpm i 16 timer inn i stasjonær fase (SP), for å bedre nøyaktig, i batch-kultur, infeksjonsforhold, og for å sikre at bakteriell virulens faktorer under kontroll av stasjonæ…

Representative Results

Sammenlignende analyse av proteinprofilene utvunnet fra den samme bakteriekultur på to forskjellige anledninger viste lignende mønstre banding indikerer suksessfulle protein ekstraksjoner. Molekylvekt proteiner utvunnet varierte 10-150 kDa. Figur 1 viser representant Coomassie blå flekker gel av de hel-celle protein utdrag fra Burkholderia multivorans (et medlem av BCC) kliniske isolater dyrket i LB eller gjær / mannitol (YEM) kjøttkraft og høstet fra stasjonær fase. <p class="jove_c…

Discussion

En fremgangsmåte for proteiner Preparatet er beskrevet som kan trekke ut mesteparten av Burkholderia proteiner med god reproduserbarhet. Dette er demonstrert ved å skaffe den samme proteinprofilen fra to uavhengige preparater utført på forskjellige dager ved bruk av samme bakteriekultur dyrket i LB-eller YEM buljong, som vist i figur 1. Utvinning var effektiv for bakterier dyrkes i flytende medier, men vi har ikke testet denne metoden for bakterier dyrket på platene. Denne metoden ble ogs?…

Materials

			Reagents
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626	Toxic, corrosive
Acetone	Fisher	A18-1	Flammable
PBS Buffer	Bioscience	R028
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher	BP118-500	toxic
Glass beads (0.1 mm)	BioSpec Products	11079101
Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)	VWR	21009-342
MicroBCA protein extraction kit	Pierce	23235
Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring	Fisher	02-681-375
2-D Clean-Up kit	GE Healthcare	80-6484-51
Urea	Invitrogen	15505-050	Irritant
CHAPS	Amersham Biosciences	17-1314-01
Dithiothreitol (DTT)	MPBiomedical, LCC	856126	Irritant
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm	Amersham Biosciences	176002-46
Duracryl	Proteomic Solutions	80-0148	Very toxic, carcinogen
Ammonium persulfate	Fisher	BP179-100	Flammable, toxic, corrosive
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Flammable
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher	BP166-500	Acute toxicity, flammable
Agarose	Invitrogen	15510-027
Ethanol	Fisher	HC1100-1GL	Flammable, toxic
Acetic acid	Fisher	A491-212	Flammable, corrosive
Glutaraldehyde	Fisher	G151-1	Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
Potassium tetrathionate	Sigma	P2926	Irritant
Sodium acetate	EM Science	7510
Silver nitrate	Sigma	209139	Corrosive, dangerous for the environment
Formaldehyde	Sigma	252549	Toxic
Sodium thiosulfate	Sigma	S7026
Tris Base	EMD	9230
Glycine	MPBiomedical, LCC	808831
Glycerol	MPBiomedical, LCC	800688
Methanol	Fisher	A412-4	Flammable, toxic, health hazard
Sodium carbonate anhydrous	EMD	SX0400-3	Toxic
Mineral oil	ACROS	415080010
			Equipment
JA-20 ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	334831
Mini Beadbeater	Biospec Products	3110BX
Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories	GE Healthcare	80-6505-03	www.amershambiosciences.com
Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system	GE Healthcare	80-6485-27	www.amershambiosciences.com