हम देशी बरकरार microvascular endothelium में कैल्शियम संकेतन visualizing और जोड़ तोड़ के लिए एक तैयारी उपस्थित थे. Endothelial ट्यूब हौसले कंकाल की मांसपेशी पड़ोसी कोशिकाओं के भीतर और बीच विवो आकारिकी और गतिशील संकेतन में बनाए रखने की आपूर्ति माउस प्रतिरोध धमनियों से अलग. Endothelial ट्यूबों अन्य ऊतकों और अंगों की microvessels से तैयार किया जा सकता है.
कंकाल की मांसपेशी कसरत के उदाहरण के रूप में प्रतिरोध vasculature से रक्त के प्रवाह के नियंत्रण, द्वारा उत्पादों चयापचय को हटाने के साथ ऑक्सीजन की आपूर्ति और पोषक तत्वों सहवर्ती को नियंत्रित करता है. Endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) सभी प्रतिरोध वाहिकाओं के intima लाइन और व्यास को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका (जैसे अन्तःचूचुक निर्भर vasodilation) की सेवा और, ऊतक रक्त प्रवाह की जिससे परिमाण और वितरण. ईसीएस द्वारा संवहनी प्रतिरोध के नियमन प्रसारण आंतरिक स्त्राव (जैसे नाइट्रिक ऑक्साइड और arachidonic एसिड मेटाबोलाइट्स) का उत्पादन होता है, जो intracellular सीए 2 + संकेतन, से प्रभावित है चिकनी पेशी सेल विश्राम प्रकाश में लाना है कि 1-3 और hyperpolarization 4,5. इस प्रकार endothelial सीए 2 + संकेतन की गतिशीलता को समझने रक्त प्रवाह नियंत्रण संचालन तंत्र को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है. Endothelial ट्यूबों अलग बीएल के साथ जुड़े confounding चर समाप्तपोत लुमेन में और आसपास के चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और नहीं तो चुनाव आयोग की संरचना और समारोह को प्रभावित जो परिवाहकीय नसों, साथ ई.. यहाँ हम इस पोत के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग बेहतर अधिजठर धमनी (सागर) से endothelial ट्यूबों के अलगाव प्रस्तुत करते हैं.
एक anesthetized माउस से endothelial ट्यूबों को अलग करने के लिए, सागर (विच्छेदन के दौरान यह दृश्यमान करने की सुविधा के लिए) पोत लुमेन भीतर रक्त बनाए रखने के लिए बगल में ligated है, और पेट की मांसपेशियों की पूरी चादर excised है. समुद्र कंकाल की मांसपेशी फाइबर और संयोजी ऊतक आसपास से मुक्त विच्छेदित है, रक्त लुमेन से प्लावित है, और हल्के enzymatic पाचन कोमल विचूर्णन का उपयोग बाह्यकंचुक, नसों और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को हटाने के लिए सक्षम करने के लिए किया जाता है. बरकरार endothelium के ये हौसले से पृथक तैयारी रासायनिक और बिजली सी स्थानांतरण करने में सक्षम, व्यक्तिगत ईसीएस कार्यात्मक रूप से एक दूसरे के लिए युग्मित शेष के साथ उनके पैतृक आकारिकी बनाए रखने केअंतराल जंक्शनों 6,7 के माध्यम से intercellularly gnals. संकेत कैल्शियम और झिल्ली बायोफिज़िक्स में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के अलावा, इन तैयारियों देशी microvascular अन्तःचूचुक भीतर जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण की आणविक अध्ययन के लिए सक्षम.
इस प्रोटोकॉल में, हम माउस समुद्र से endothelial सेल ट्यूबों के अलगाव का वर्णन. समुद्र पूर्वकाल पेट की मांसलता को आंतरिक वक्ष धमनी और आपूर्ति ऑक्सीजन युक्त रक्त से उत्पन्न होती है. हमारे एक मॉडल के रूप में समुद्र के साथ काम कर रहा यह चिकनी पेशी सेल विश्राम गवर्निंग और समन्वय में अन्तःचूचुक की भूमिका अंतर्निहित कहनेवाला संकेत घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि अपेक्षाकृत लंबे, unbranched microvessel क्षेत्रों प्रदान करने के कारण है. कंकाल की मांसपेशी के अलावा अन्य ऊतकों में रुचि रखने वालों के लिए, हम आसानी से मस्तिष्क, पेट और लसीका प्रणाली के microvessels से endothelial ट्यूब प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए इस तकनीक को मिल गया है.
इस विधि की प्रमुख विशेषताओं microvascular endothelium के बरकरार लंबाई (1-3 मिमी) 7-9 संकेत +, पृथक वे पीएसएस के साथ superfused कर रहे हैं, जिसमें एक प्रवाह चैम्बर में एक गिलास coverslip के खिलाफ सुरक्षित है, और 2 सीए के लिए imaged हैं या कर रहे हैं किबिजली के संकेत 6,8 के लिए impaled. प्रवाह कक्ष के भीतर, एक ट्यूब के ऊपरी आधे superfusion समाधान के संपर्क में है और प्रयोगात्मक उपायों का जवाब है, (coverslip के साथ संपर्क में) नीचे आधा सुरक्षित है, जबकि और मौन रहता है. दोनों के भीतर और कहनेवाला सीए 2 + संकेत घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इसके अलावा, endothelial ट्यूब प्रोटीन अभिव्यक्ति 6,10 जांच करने के लिए जीन अभिव्यक्ति 6,10, immunohistochemistry का आकलन करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और electrophysiological पढ़ाई biophysical गुणों को परिभाषित करने के लिए बिजली के चालन 6,11 की.
Endothelial समारोह के अध्ययन के लिए endothelial ट्यूब तैयारी करने के कई फायदे हैं. आम तौर पर 'सी' जब आकार, (व्यक्तिगत रूप से अलग (ट्यूब गठन में रहते हैं जो) endothelial कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं: पहले अलगाव प्रक्रिया दो सेल आबादी के बीच एक सरल गौरव प्रदान करता हैआराम से). इस चयनात्मक नमूना और पोत समारोह के लिए संबंधित कोशिकाओं 'योगदान अंतर्निहित अद्वितीय गुणों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. दूसरा, इस मॉडल चिकनी मांसपेशियों, नसों, और पैरेन्काइमा आसपास के, रक्त प्रवाह के प्रभाव से स्वतंत्र, endothelium के लिए आंतरिक घटनाओं संकेत का संकल्प सक्षम बनाता है. हौसले जिससे जीन या सेल संस्कृति के साथ जुड़े प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन से बचने, पृथक जबकि तीसरा, अन्तःचूचुक अध्ययन किया है.
यहाँ हम समुद्र से endothelial ट्यूबों के अलगाव और उसके विधान ईसीएस के भीतर संकेत घटनाओं + 2 सीए कल्पना करने के लिए इस तैयारी के उपयोग का वर्णन. यह प्रक्रिया मूल रूप से हम्सटर cremaster मांसपेशियों 8 की धमनियों से endothelial ट्यूबों को अलग करने के लिए विकसित एक से लिया गया था. हम्सटर प्रत्याकर्षक मांसपेशियों और गाल की फीड धमनियों थैली arterioles 10, माउस बेहतर अधिजठर धमनी 6,7,9, माउस mesenteric और मस्तिष्क: यहां प्रस्तुत तकनीक की मामूली बदलाव का उपयोग, हम सहित संवहनी बेड की एक किस्म से endothelial ट्यूब, अलग है धमनियों और लसीका microvessels (अप्रकाशित टिप्पणियों; संदर्भ mesenteric वाहिकाओं 12 और मस्तिष्क वाहिकाओं 13 अलग करने के लिए शामिल किए गए हैं). नई संवहनी बेड से endothelial ट्यूबों अलग मूल प्रोटोकॉल के लिए संशोधन की आवश्यकता हो सकती. अलगाव असफल होता है, यह पाचन बार बदलकर शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है:Endothelial ट्यूबों चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और बाह्यकंचुक से अलग और endothelial ट्यूब बरकरार न रह जाए, तो पाचन के समय को कम करने के लिए मुश्किल हैं अगर पाचन समय बढ़ाएँ. पाचन बार फेरबदल असफल होता है, पाचन एंजाइमों की एकाग्रता या पाचन तापमान एडजस्ट करने की कोशिश की जानी चाहिए. एक अन्य विकल्प चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को हटाने में कतरनी बल बढ़ता है जो विचूर्णन पिपेट, का आंतरिक व्यास को कम करना है. तरल पदार्थ इंजेक्शन का वेग बढ़ाने से भी एक ही प्रभाव के लिए कोशिश की, लेकिन तैयारी को नुकसान होने की संभावना है किया जा सकता है. यह endothelial कोशिकाओं अच्छी तरह junctional प्रोटीन से एक दूसरे से जुड़े नहीं हैं जो में जहाजों से बरकरार endothelial ट्यूबों को अलग करना संभव नहीं हो सकता है कि मान्यता प्राप्त होना चाहिए.
Enzymatic पाचन निम्नलिखित चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की हदबंदी शुरू में एक हाथ शैली pipettor 8 उपयोग किया गया था. हम एक microsyr का उपयोग विचूर्णन प्रक्रिया परिष्कृत किया हैअब endothelial ट्यूबों के अनुरूप अलगाव (अप करने के लिए 3 मिमी) 6 सक्षम है जो Inge प्रणाली,. इस प्रणाली का उपयोग करते हैं, विचूर्णन पिपेट द्रव आंदोलन और पोत खंड युक्त पीएसएस नियंत्रित पिस्टन के बीच एक सतत द्रव स्तंभ प्रदान करने के लिए खनिज तेल के साथ backfilled है. पोत के रूप में लगातार कतरनी में microsyringe पिस्टन के परिणाम की निरंतर प्रेरणा शक्ति के साथ तरल पदार्थ की असंपीड्यता पिपेट टिप के माध्यम से मजबूर है. इसके विपरीत, अक्सर अलग कर कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया हाथ तकनीक (जैसे एक पाश्चर विंदुक के अंत में रबर बल्ब फैलाएंगे) ड्राइविंग दबाव में परिवर्तनशीलता का परिचय जो हवा के संपीड़न, और, इस प्रकार, कतरनी पिपेट टिप पर exerted शामिल है.
Microvessels में endothelial समारोह के अध्ययन के लिए ट्यूब तैयारी करने के लिए कई फायदे हैं. पहले अलगाव प्रक्रिया ईसीएस के अलग समरूप देशी सेलुलर आबादी और चिकनी म्यू प्रदान करता हैscle कोशिकाओं. ईसीएस शारीरिक रूप से ट्यूबों के रूप में जुड़े रहने के बाद, वे विचूर्णन दौरान आराम से रहना अगर एक 'सी' विन्यास बनाए रखने जो व्यक्ति चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं. इस प्रकार संबंधित प्रकार की कोशिकाओं में आसानी से पहचाना जाता है जैसे इस तरह के वास्तविक समय पीसीआर और immunohistochemistry के रूप में 10 आणविक तकनीक के लिए नमूने प्राप्त करने के लिए जब. कई ट्यूबों एक एकल पोत से (या समुद्र के लिए किया ही द्विपक्षीय जहाजों से) अलग कर रहे हैं के बाद से, आणविक डेटा और कार्यात्मक डेटा किसी दिए गए पशु का एक ही वाहिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकार आणविक अभिव्यक्ति microvascular endothelium के कार्य व्यवहार के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है. इसके अलावा, microvascular endothelium के लिए आंतरिक अंतर और कहनेवाला दोनों संकेत घटनाओं hemodynamic बलों (दबाव, प्रवाह), रक्त प्रवाह (जैसे हार्मोन) में किए गए vasoactive एजेंटों के प्रभाव से स्वतंत्र सुलझाया जा सकता है, या आसपास के चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से (जैसे60; myoendothelial युग्मन 14-16) के माध्यम से, नसों 17, या ऊतक पैरेन्काइमा 18.
अन्तःचूचुक हौसले नामित microvessels से अलग है क्योंकि महत्वपूर्ण बात है,, अन्यथा संवर्धन ईसीएस 19-21 के साथ जुड़ा हुआ है कि phenotype के कोई परिवर्तन नहीं है. उदाहरण के लिए, सुसंस्कृत ईसीएस muscarinic रिसेप्टर अभिव्यक्ति खो और इस तरह उनके संकेत कैल्शियम प्रोफाइल को बदल. इसके अलावा, ईसीएस के electrophysiological गुणों संस्कृति 22 में बदल सकते हैं. व्यक्तिगत ईसीएस कार्यात्मक अंतराल जंक्शन चैनलों के माध्यम से युग्मित रहते है क्योंकि, endothelial ट्यूब कोशिकाओं 6,7 के बीच बिजली और सीए 2 + संकेतों के चालन के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रस्तुत करता है. यह भी अलग चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को आसानी से microvascular समारोह 23 अंतर्निहित पूरक डेटा के लिए पैच दबाना तकनीक के साथ अध्ययन कर रहे हैं कि मान्यता प्राप्त होना चाहिए.
Endothelial ट्यूब एम के लिए एक प्रमुख सीमाODEL तापमान में वृद्धि के साथ तैयारी की अस्थिरता है. समुद्र से हमारी तैयारी परिवेश कमरे के तापमान (~ 24 डिग्री सेल्सियस) में और 32 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटे के लिए स्थिर और स्वस्थ सिद्ध कर दिया है, रूपात्मक और कार्यात्मक गिरावट 37 डिग्री सेल्सियस 9 में एक घंटे से भी कम समय में होते हैं. Endothelial ट्यूब का एक दूसरा महत्वपूर्ण सीमा बरकरार पोत दीवार 14-16 में चुनाव आयोग के समारोह का अभिन्न अंग हैं कि myoendothelial जंक्शनों और अपने निहित संकेतन डोमेन का नुकसान हुआ है. यह भी मान्यता दी जानी चाहिए, कि अब ट्यूबों वे लंबे समय तक पाने के रूप में यह पूरी तरह से चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और बाह्यकंचुक आसपास अलग कर देना करने के लिए और अधिक कठिन हो जाता है क्योंकि ट्यूबों की तैयारी जटिल है अपेक्षाकृत काफी दूरी 6, पर अध्ययन किया जा कहनेवाला संकेतन सक्षम है. हम 1-2 मिमी से अधिक लंबी ट्यूब भी स्थिति और प्रवाह चैम्बर में सुरक्षित करने के लिए और अधिक कठिन हो पाया है. इसके विपरीत, छोटी नलियों (जैसे <1 मिमी) ENA जबकि8 अध्ययन किया जा ble सीए 2 + और विद्युत संकेतों, वे प्रवाह चैम्बर में superfusion दौरान बनाए रखने के लिए मुश्किल हो जाता है. Immunolabeling प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का एक सूचकांक प्रदान करता है, हालांकि अंत में, यहाँ तक कि द्विपक्षीय ट्यूबों के इष्टतम अलगाव के साथ, पश्चिमी blots का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति की पारंपरिक मात्रा का ठहराव के लिए अपर्याप्त सामग्री, वहाँ है. ऐसी सीमाओं के बावजूद, endothelial ट्यूब विवो में microvascular endothelial सेल समारोह के तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एक उपन्यास तैयारी का प्रतिनिधित्व करता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों पांडुलिपि तैयार करने में संपादकीय टिप्पणियों के लिए डॉ. Pooneh Bagher और डॉ. एरिका Westcott धन्यवाद. इस काम के पुरस्कार संख्या R37-HL041026 और एसएसएस के लिए R01-HL086483 और MJS लिए F32-HL107050 के तहत राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के रक्त संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. इस सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
Papain | Sigma | P-4762 | |
Collagenase | Sigma | C-8051 | |
Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
Sylgard | Dow Corning | 184 | |
Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |