Denna femdagars-protokollet beskriver alla steg, utrustning och extra programvara som krävs för att skapa och driva en effektiv endogen Escherichia coli baserad TX-TL cellfria expressionssystem från grunden. Med reagenser, tar det protokoll 8 timmar eller mindre att installera en reaktion, samla in och bearbeta data.
Idealiska cellfria expressionssystem kan teoretiskt emulera en in vivo cellmiljö i en kontrollerad in vitro-plattform. 1 Detta är användbart för att uttrycka proteiner och genetiska kretsar på ett kontrollerat sätt samt för att ge en prototypmiljö för syntetisk biologi. 2,3 För att uppnå det senare målet, cellfria expressionssystem som bevarar endogen Escherichia coli mekanismer transkription-översättning kan bättre återspeglar cellulära dynamik in vivo än de som baseras på T7 RNA-polymeras transkription. Vi beskriver förberedelserna och genomförandet av ett effektivt endogen E. coli baserade transkription-translation (TX-TL) cellfria expressionssystem som kan ge likvärdiga mängder protein som T7-baserade system med en 98% kostnadsminskning till liknande kommersiella system. 4,5 Beredningen av buffertar och råcellextrakt är beskrivs, liksom utförandet av entre rör TX-TL reaktion. Hela protokollet tar fem dagar att förbereda och ger tillräckligt med material för upp till 3000 enkla reaktioner i en beredning. Efter beredning, tar varje reaktion under 8 timmar från installation till datainsamling och analys. Mekanismer för reglering och transkriptions exogena till E. coli, såsom lac / Tet-repressorer och T7 RNA-polymeras, kan kompletteras. sex Endogena egenskaper, såsom mRNA och DNA nedbrytningshastigheter kan också justeras. 7 TX-TL cellfritt expressionssystem har visats för stor- skala kretskort, utforska biologiska fenomen och uttryck av proteiner under både T7-och endogena promotorer. 6,8 Kompletterande matematiska modeller finns tillgängliga. 9,10 Det resulterande systemet har unika tillämpningar inom syntetisk biologi som en prototypmiljö, eller "TX- TL biomolekylära bakbord. "
Cell-yttrandefrihet tekniken började på 1950-talet som rent translationell, avancera år senare att omfatta kopplade mekanismer transkription-översättning med hjälp av T7 bakteriofag-DNA. 11,12 Sedan dess har många försök gjorts för att optimera skapandet av råcellextrakt (eller E . coli S30-extrakt). 13,14 Dessa optimeringar inkluderar förlänga cellfria proteinsyntes genom ATP-regenerering eller stam modifieringar, och minska protokoll tid och kostnad. existerar 15-17 Alternativa cellfria expressionssystem som använder rekonstituerade komponenter i stället för råolja cellextrakt för uttryck. 5 Både råcellextrakt och beredning metoder har utvecklats för kommersiellt bruk.
Med tillkomsten av syntetisk biologi, finns det ett ökat behov av en väldefinierad plattform för att testa och uttrycka manipulerade biologiska moduler och kretsar. 18,19 Denna plattform ska varamångsidig, väldefinierad, enkla att manipulera, och fokuserat på användar inköpta komponenter. Trots att utvecklas ett halvt sekel tidigare cellfria system baserade på E. coli dela sig är dessa krav, eftersom de är en förenklad in vitro-representation av cellulära processer utan komplexiteten av tillväxt och metabolism. Dessutom har alla de grundläggande kunskaper från in vivo arbete på E. coli gäller lätt till E. coli cellfria system.
Trots att cellfria expressionssystem kan ha tillämpningar inom syntetisk biologi, hittills målet för de flesta cellfria expressionssystem har varit att maximera protein och metabolit avkastning. Detta åstadkommes genom användning av T7-bakteriofag-transkription av sekvenser som drivs av T7-promotorer. 20 Även om uttrycket är effektiv och robust, dessa system tjänar en högspecialiserad syfte. Cellregleringsmetoder är begränsade, måste mål-DNA-mallar varaomarbetade för att inkludera T7-promotorer, och vissa sekvenser såsom ribosomala komplex inte kan transkriberas och monteras. 21,22 Befintliga cellfria expressionssystem inte kan upprätthålla hög avkastning samtidigt som endogena reglerande mekanismer, en mångsidighet som behövs för syntetisk biologi.
Vi har utvecklat en endogen E. coli cellfria expressionssystem som bevarar effektiviteten i proteinuttryck framgår av tidigare system, men lägger till ytterligare mångsidighet genom att tillåta uttryck och reglering baserad på både endogena och exogena (T7 eller andra) mekanismer. Protokollet som beskrivs här är ursprungligen baserad på Kigawa et al. (2004) och Liu et al. (2005), men har betydande förändringar. Den använder Mg-och K-glutamat över Mg-och K-acetat för ökad effektivitet, avlägsnar 2-merkaptoetanol, och lyserar cellerna genom att använda en Bead-Beater. 17,23,24 Bead-stryk väljs framför homogenisering,tryckbaserade metoder eller ultraljudsbehandling på grund av dess lägre kostnad och med jämförbara utbyten till konkurrerande system. 23 3-phosphoglyceric acid (3-PGA) används som energikälla, eftersom man fann att ge överlägsna proteinutbyten jämfört med kreatinfosfat och fosfoenolpyruvat. 4,25 Vårt system kan producera upp till 0,75 mg / ml reporter protein med hjälp av antingen en sigma70 baserad promotor med lambda-fag operatörer eller en T7-driven promotor, liknande avkastning från andra kommersiella system. 4,6 Fem dagar krävs för att producera alla nödvändiga reagenser (Figur 1). Dessutom ger det en minskning 98% kostnad än andra kommersiella cellfria system – materialkostnader är $ 0,11 per 10 pl reaktion, som stiger till 0,26 $ med arbetskraft ingår (Figur 2).
Den endogena Escherichia coli baserad TX-TL cellfria expressionssystem som beskrivs här är en enkel att köra tre rör reaktion som kan ta mindre än åtta timmar från inrättats för att datainsamling. Processen att skapa alla reagenser kräver fem dagars tid totalt (med stora behov av arbetskraft på bara en dag), men producerar råextrakt för 3.000 reaktioner och buffert-göra reagenser för 10.000 reaktioner (Figur 1). Dessutom råextrakt och buffert-göra reagenser är stabila i minst 1 år vid -80 ° C, vilket möjliggör flera användningsområden för ett preparat. 4 På $ 0,11 per 10 pl reaktion ($ 0,26 inklusive arbetskraft), kostnaderna är 98% lägre än jämförbara kommersiella system (figur 2).
Det finns några olösta begränsningar emellertid till systemet. Slut effektivitet varje råcellextrakt preparatet kan variera beroende på användarens kompetens och miljöförhållanden, även om typical avkastning variationen är mellan 5-10% (figur 4b). Som ett resultat, batch-till-batch variation i både slutpunkten uttryck och uttrycksdynamik är att vänta. Dessa variationer kommer sannolikt att förbli tills extraktet helt karaktäriseras eller tills extrakt skapelsen är helt automatiserad. Om cellfria expressionssystem används för att utföra känsliga kvantitativa experiment, är det lämpligt att köra alla experiment med samma parti av råcellextrakt. Utbytet från en enda råcellextrakt sats, cirka 3000 reaktioner bör vara tillräckliga för typiska experimentella kurser. Även om vi misstänker att variationen kan tas bort genom att skala upp och automatisera förfarandet, skulle sådana försök innebär en betydande investering resurs.
Dessutom, även om slutpunkten uttrycksnivåer är relativt lätt att avgöra, behöver mer arbete att göra för att förstå dynamiken inneboende till cellfritt system. Det är känt att både resurs KONKURRENSn och resursbegränsning kan påverka uttrycks dynamik. Exempelvis kan begränsad endogen sigma 70 resultera i en mätt regim med ökad DNA-mall som producerar en expressionsprofil analogt med det i nukleotid-eller aminosyra utarmning. 9,27 dock dynamiken har inte till fullo förstås att utnyttja systemet. För rena ökningar av avkastningen, kan optimering göras av maskinlärandestrategier. 28 Frågor om resurskonkurrens och begränsning kan åtgärdas genom matematiska modeller verifieras med hjälp av experimentella data.
Protokollet presenteras här är optimerad för en BL21-Rosetta2 stam, men är generaliserbara till andra E. coli-stammar. Modifieringar i BL21-Rosetta2, såsom avlägsnande av den gen som kodar lon proteas och tillsättning av gener som kodar sällsynta tRNA, möjliggöra maximal proteinproduktion. Vi har försökt protokollet med två andra stammar extrakt – bara BL21 och BL21 TrxA knockout-end fann 50% lägre proteinavkastning. Vår hypotes är att avkastningen på motsvarande sätt minskar vid användning av andra stammar. Övriga förändringar av parametrar, som till exempel att byta 2xYT tillväxtmedium för LB och andra rika buljonger, har resulterat i minskad proteinavkastning.
Cellfria expressionssystem utnyttjar både endogena och exogena transkription-translation maskiner och regleringsmekanismer har breda tillämpningar inom både protein och metabolit uttryck och i syntetisk biologi. 3,29 Istället för att vara begränsad till T7-reglerade kretsar, kan man föreställa sig att producera komplexa biomolekyler på ett användar kontrollerbar miljö med hjälp av en blandning av infödda E. coli-promotorer och exogent medföljande transkription och reglermekanismer. Utan begränsningar av celldelning och metabolism, kan variationen i syntetiska kretsar såsom repressilator eller metaboliska konstruerad vägar som de som producerar artemisinin minskas eller bättre förstås. 30,31 Vi HAVe använt dessa fördelar för att genomföra genetiska switchar, samt att förstå sigmafaktor kvarstad 9,32 Sådan teknik kan också utgöra ryggraden i "minimal" eller "artificiella" celler -. liten, väl karakteriserad och självförsörjande förkroppsligad enheter extrakt. 33,34
I slutändan, vi räknar med omedelbar användning av denna endogena cellfria expressionssystem som ett prototypmiljö för syntetisk biologi. Och kallas "TX-TL biomolecular breadboard", det cellfria expressionssystem tillhandahåller en styrbar miljö där syntetiska kretsar slutligen avsett för in vivo-uttryck kan genomgå rundor av prototyper – cykler av testning på grundläggande plasmid, linjär, eller kemiskt syntetiserade DNA: t, följt genom analys och snabb förändring. Prototyp rundor kan vara hjälpt av prediktiva matematiska modeller håller på att utvecklas. Genom att ta bort kloning och in vivo manipulation för icke-slutkretsar, räknar vi ingenjörerneering cykeltiderna reduceras till 1-3 dagar i stället för de aktuella veckors standard.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, och Enoch Yeung om hjälp att effektivisera protokollet, och Clare Chen och Barclay Lee för att få hjälp i ett tidigt skede av projektet. Detta material är baserat på arbete stöds delvis av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living Gjuterier program, kontraktsnummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS stöds också av en UCLA / Caltech Medical Scientist träningsprogram gemenskap och genom en DoD, flygvapnet Office of Scientific Research, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. De åsikter och slutsatser i detta dokument är författarnas egna och ska inte tolkas som officiellt politik, varken uttryckligen eller underförstått, för Defense Advanced Research Projects Agency och den amerikanska regeringen.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
Bacto-agar | BD Diagnostics | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | BioSpec | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | BioSpec | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
CTP | USB | 14121 | |
Cuvettes, 1.5ml | Fisher | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
GTP | USB | 16800 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo-Scientific | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo-Scientific | 232701 | |
PEG-8000 | Promega | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
Tris base | Fischer | BP1521 | |
tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
UTP | USB | 23160 | |
1L Centrifuge Bottle | Beckman-Coulter | A98813 | This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use. |
4L Erlenmeyer Flask | Kimble Chase | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP Centrifuge | Beckman-Coulter | 393127 | Or 1L-capable centrifuge equivalent. |
Forma 480 Orbital Shaker | Thermo Scientific | 480 | Or chest-size 6x4L shaker equivalent. |
JLA-8.1000 Rotor | Beckman-Coulter | 363688 | Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge. |
Mini-Beadbeater-1 | BioSpec | 3110BX | |
Supplemental Material 1. Recipes for Items. Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. 2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 °C and add 40 μl Cm. Aliquot 25 ml into a 100×15 mm petri dish, and let cool for an hour. 2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2×1.88 L and 0.24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 4 ml 1 M DTT before use. S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 2 ml 1 M DTT before use. HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 μl. CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 μl. NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 μl. (Add 27 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 μl. (Add 73 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. Spermidine: Prepare 23.55 μl of spermidine (MW 145.25) and water to 150 μl. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 °C. 3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 μl of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). Supplemental Material 2. Bradford Assay.
See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx. Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. See TXTL _JoVE.xlsx. |