अलगाव और अनुभवहीन सीडी 4 टी lymphocytes की Th17 भेदभाव
Summary
अन्य टी सेल सबसेट से अलग प्रेरक कार्यों के साथ, Th17 कोशिकाओं केंद्रीय भड़काऊ autoimmunity में फंसाया गया है. यह इन विट्रो Th17 भेदभाव प्रोटोकॉल भोले सीडी 4 + टी lymphocytes Th17 कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं, और आगे औतोइम्मुिनित मेजबान प्रतिक्रिया में उनकी भूमिका की जांच करने के लिए तय है कि एक साधन प्रदान करता है.
Abstract
Th17 कोशिकाओं 17 (आईएल -17) इंटरल्यूकिन उत्पादन पाया गया है कि टी कोशिकाओं की एक विशिष्ट सबसेट हैं, और TH1, Th2, और विनियामक टी कोशिकाओं सहित अन्य टी सेल सबसेट से समारोह में मतभेद है. Th17 कोशिकाओं कई autoimmune विकारों के साथ जुड़े अति उत्साही भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक केंद्रीय अपराधी के रूप में उभरा है. इस विधि में हम C57BL 6 / चूहों की तिल्ली और लिम्फ नोड्स से टी lymphocytes शुद्ध, और नियंत्रण और Th17 उत्प्रेरण वातावरण के तहत शुद्ध सीडी 4 + टी कोशिकाओं को उत्तेजित. Th17 उत्प्रेरण पर्यावरण विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी, आईएल -6, और TGF-β की उपस्थिति में उत्तेजना भी शामिल है. कम से कम 72 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद और 37 डिग्री सेल्सियस के ऊपर से पांच दिनों के लिए, कोशिकाओं बाद cytometry, qPCR, और ELISAs प्रवाह के माध्यम से आईएल -17 का उत्पादन करने की क्षमता के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. Th17 भेदभाव सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं आगे Th17 कोशिकाओं औतोइम्मुिनित मेजबान डे की शुरुआत प्रगति में खेलने उस भूमिका को स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जा सकता हैfense. इसके अलावा, अलग murine पीटकर / रोग मॉडल से सीडी 4 + CD25 लिम्फोसाइटों की Th17 भेदभाव सेल भाग्य plasticity की हमारी समझ के लिए योगदान कर सकते हैं.
Introduction
सीडी 4 + टी lymphocytes (टी कोशिकाओं) संक्रामक सूक्ष्मजीवों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली की मध्यस्थता रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इसके विपरीत, टी कोशिकाओं को भी परिचित टाइप 1 मधुमेह, प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष, और रुमेटी गठिया जैसे autoimmune रोग की शुरुआत प्रगति के साथ जुड़े रहे हैं. सीडी 4 + टी lymphocytes टी सेल रिसेप्टर आत्मीय प्रतिजन / प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल द्वितीय (MHCII) अणुओं के साथ (TCR) वार्तालाप का एक संयोजन के माध्यम से सक्रिय हो जाते हैं, और B7.1/B7.2 साथ CD28 रिसेप्टर बातचीत 15 ligands. TCR उत्तेजना और CD28 सह उत्तेजना के प्रावधान के अलावा, प्रतिजन कोशिकाओं पेश भी इस तरह दिया प्रतिजन के लिए टी लिम्फोसाइट की प्रतिक्रिया निर्देशन, टी लिम्फोसाइट का भेदभाव राज्य निर्धारित करता है जो एक साइटोकाइन वातावरण प्रदान करते हैं. अलग रोगज़नक़ / प्रतिजन पेश सेल बातचीत टी एली पर ध्यान केंद्रित अलग रास्ते नीचे लिम्फोसाइटों तिरछा जो अलग साइटोकाइन वातावरण बनाने के लिए,की शुरुआत रोगज़नक़ की mination. दुर्भाग्य से, मूल रूप से रोगजनकों हमलावर उन्मूलन करने के लिए डिजाइन टी लिम्फोसाइट प्रेरक रास्ते,, ग़लती से आत्म ऊतकों 15 के खिलाफ निर्देशित किया जा सकता है. इसलिए, प्रत्येक विशिष्ट सीडी 4 + टी सेल सबसेट के भेदभाव राज्य की बेहतर समझ रोगजनकों के उन्मूलन और स्वयं के लिए सहिष्णुता के बीच संतुलन को व्यवस्थित करना कैसे के बारे में हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है.
TH1, Th2, और inducible विनियामक टी सेल भेदभाव रास्ते के अलावा, भोले टी lymphocytes भी Th17 मार्ग नीचे साइटोकिन्स के द्वारा संचालित किया जा सकता है. TH1 कोशिकाओं मुकाबला intracellular रोगज़नक़ों जबकि, Th2 कोशिकाओं कोशिकी रोगजनकों समाप्त करने, और विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 1, 16 को कम; Th17 कोशिकाओं कोशिकी बैक्टीरिया और कवक के उन्मूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. Th17 कोशिकाओं आम तौर पर वंश विशेष प्रतिलेखन कारक RORγT और आईएल के उत्पादन की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित हैंमैक्रोफेज और neutrophils 1, 7 की सक्रियता को बढ़ावा देता है जो-17A,.
Th17 कोशिकाओं कई autoimmune विकारों में फंसा, और उनके संबद्ध कृंतक मॉडल किया गया है. उदाहरण के लिए, यह आईएल -23 (Th17 phenotype बनाए रखने के लिए आवश्यक है), जो कि प्रदर्शन किया गया है, लेकिन नहीं आईएल -12, प्रयोगात्मक autoimmune इन्सेफेलाइटिस (EAE) में केंद्रीय अपराधी था, एमएस के लिए कृंतक रोग मॉडल. यह बाद में आईएल -17 उत्पादन में कटौती EAE रोकथाम 2, 6, 17 को सहसंबद्ध होते हैं कि दिखाया गया है. इसके अलावा, Th17 कोशिकाओं गठिया और प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष erythematosus (SLE) 10, 16 सहित अन्य autoimmune विकारों के साथ संबद्ध किया गया है. आईएल 23 की कमी p19 – / – चूहों Th17 कोशिकाओं की बहुत कम संख्या है दिखाया, और EAE न केवल विकसित करने के लिए प्रतिरोधी रहे थे, लेकिन यह भी कोलेजन प्रेरित गठिया, संधिशोथ 10, 18 के लिए एक मॉडल. इसके अलावा, चूहों पीछे आईएल 17A एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने के साथ इलाजएर कोलेजन प्रेरित गठिया की शुरुआत भी संयुक्त नुकसान 18 के संकल्प है पाया गया. यह हाल ही में शोध भी टाइप 1 मधुमेह 9, 11 और आंतों में सूजन 14 में Th17 कोशिकाओं की एक सुरक्षात्मक भूमिका दिखाया गया है जैसे autoimmune रोग की प्रगति में Th17 कोशिकाओं की भूमिका की विशेषता जाना बना रहता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इन अध्ययनों autoimmunity में Th17 भेदभाव के महत्व की पुष्टि करें.
1) कैसे ठीक आईएल -6 Treg और Th17 भेदभाव के बीच संतुलन को विनियमित करता है, और 2) सटीक तंत्र क्या कर रहे हैं: आगे की जांच पड़ताल की आवश्यकता है कि कम से कम दो हैरान करनेवाला सवाल कर रहे हैं क्योंकि इन विट्रो Th17 भेदभाव में टी सेल अनुसंधान में एक आवश्यक तरीका है आईएल -17 प्रेरित भड़काऊ विकारों के पीछे? हमारे विधि C57BL 6 / माउस के spleens और लिम्फ नोड्स से सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं को रोजगार. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि यह एक अशुद्ध का उपयोग Th17 भेदभाव उत्पन्न करने के लिए संभव है, हालांकिआबादी, कम से कम एक 80% शुद्ध सीडी 4 + CD25-टी सेल की आबादी प्राप्त संदूषण की कोई चिंता नकारती और अधिक सफल Th17 भेदभाव परिणाम सुनिश्चित करता है. उचित Th17 भेदभाव को प्राप्त करने के लिए, सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं क्रमशः विरोधी CD3 और विरोधी CD28, सक्रियण संकेतों प्रदान है, जो 1 और 2, की उपस्थिति में incubated हैं, और आईएल -6, और TGF-β. यह आईएल -23 अकेले Th17 भेदभाव को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बताया गया है कि हालांकि, यह बाद में आईएल -23 Th17 सेल जनसंख्या की स्थिरता के लिए आवश्यक है कि प्रदर्शन किया गया, लेकिन आईएल -6 और TGF-β Th17 भेदभाव के लिए आवश्यक हैं 3, 18, 19. Murine पढ़ाई आईएल -23 रिसेप्टर वे आईएल -6 और TGF-β 13, 18 के साथ प्रेरित किया गया है के बाद ही सीडी 4 + टी कोशिकाओं पर व्यक्त की है कि पता चला है. इसके अलावा, Th17 कोशिकाओं सफलतापूर्वक के रूप में लंबे आईएल -6 और TGF-β 18, 19 में मौजूद हैं आईएल -23 अवरुद्ध एंटीबॉडी की उपस्थिति में विकास होगा. जैसे, इस Th17 भेदभाव प्रोटोकॉल Provसफलतापूर्वक Th17 भेदभाव प्रेरित करने के लिए उपयुक्त परिस्थितियों इडस. Autoimmune विकार 13 के उद्देश्य से बेहतर चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए अवसर मौजूद Th17 भेदभाव और आईएल -17 उत्पादन अंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ का विकास.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम इन विट्रो Th17 भेदभाव को प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. टी के भेदभाव मानव रोगजनकों 13 की प्रभावी उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण है Th17 सबसेट में लिम्फोसाइटों के रूप में Th17 भेदभाव क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम फ्लोरिडा TL1 TR000066 और UL1 TR000064, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, एक बी.डी. बायोसाइंसेज अभिकर्मक अनुदान से पैरेंट अनुदान R01AI056152 से एक विविधता के पूरक के विश्वविद्यालय के लिए एनआईएच / NCATS नैदानिक और translational विज्ञान पुरस्कार, और विश्वविद्यालय के हिस्से में समर्थित है फ्लोरिडा की.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3″ x 1″1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-MercaptoEthanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad |
Referências
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