मल्टी गहराई परिपत्र क्रॉस अनुभागीय Endothelialized microchannels पर एक चिप के विकास के लिए प्रक्रिया
Summary
एक microchannels पर एक चिप मंच photolithographic reflowable photoresist तकनीक, मुलायम लिथोग्राफी, और microfluidics के संयोजन के द्वारा विकसित किया गया था. endothelialized microchannels मंच, विवो microvessels में की तीन आयामी (3 डी) ज्यामिति mimics नियंत्रित निरंतर छिड़काव प्रवाह के अंतर्गत चलाता है, उच्च गुणवत्ता और वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और microvascular अनुसंधान के लिए लागू किया जा सकता है.
Abstract
Vivo में जानवरों के अध्ययन में अधिक समय लेने, महंगा, और प्रेक्षण और मात्रा का ठहराव बहुत चुनौती दे रहे हैं क्योंकि प्रयासों microvessels के अध्ययन के लिए इन विट्रो assays में विकास पर ध्यान केंद्रित किया गया है. तीन आयामी (3 डी) ज्यामिति के संबंध में विवो microvessels में प्रतिनिधित्व करने और सतत द्रव प्रवाह प्रदान हालांकि, जब इन विट्रो microvessel assays में पारंपरिक सीमाएं हैं. Photolithographic reflowable photoresist तकनीक, मुलायम लिथोग्राफी, और microfluidics का एक संयोजन का उपयोग करना, हम एक बहु गहराई परिपत्र पार के अनुभागीय endothelialized विकसित किया है नियंत्रित निरंतर छिड़काव के तहत विवो microvessels में से 3 डी ज्यामिति mimics और चलाता है, जो microchannels-a-चिप पर प्रवाह. एक सकारात्मक reflowable photoresist के एक semicircular पार के अनुभागीय microchannel के नेटवर्क के साथ एक मास्टर मोल्ड के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था. Repl दो polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels के संरेखण और संबंधों सेमास्टर मोल्ड से icated, एक बेलनाकार microchannel के नेटवर्क बनाया गया था. microchannels की व्यास अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है. इसके अलावा, चिप के अंदर वरीयता प्राप्त प्राथमिक मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) कोशिकाओं 4 दिनों के लिए 2 सप्ताह के बीच एक समय अवधि के लिए स्थायी नियंत्रित छिड़काव के तहत microchannels की भीतरी सतह लाइन में खड़ा दिखाया.
Introduction
Microvessels, परिसंचरण तंत्र के एक भाग के रूप में, रक्त और ऊतकों के बीच बातचीत में मध्यस्थता चयापचय गतिविधियों का समर्थन, ऊतक microenvironment परिभाषित है, और कई स्वास्थ्य और रोग की स्थिति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इन विट्रो में कार्यात्मक microvessels का संक्षिप्त जटिल संवहनी घटनाओं के अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है. हालांकि, इस तरह endothelial सेल प्रवास assays है, endothelial ट्यूब गठन assays, और चूहा और माउस महाधमनी अंगूठी assays के रूप में इन विट्रो microvessel assays है, में पारंपरिक तीन आयामी (3 डी) ज्यामिति और निरंतर प्रवाह नियंत्रण के संबंध में विवो microvessels में विश्राम करने में असमर्थ हैं 1-8. पशु मॉडल और ऐसे कॉर्निया angiogenesis को परख, लड़की chorioallantoic झिल्ली angiogenesis को परख, और Matrigel प्लग परख के रूप में vivo assays है, में उपयोग कर microvessels का अध्ययन अधिक, समय लेने वाली लागत में उच्च, प्रेक्षण और quantifications के संबंध में चुनौती दे रहा है, और कर रहे हैंनैतिक मुद्दों 1, 9-13 बढ़ा.
नहीं होगा जो इस तरह आसानी से और कसकर नियंत्रित जैविक शर्तों और गतिशील fluidic वातावरण के रूप में पढ़ाई 14, जानवरों के साथ और इन विवो में जुड़े उच्च प्रयोगात्मक लागत और जटिलताओं कटौती करते हुए micromanufacturing और microfluidic चिप प्रौद्योगिकियों में अग्रिम जैव चिकित्सा विज्ञान में अंतर्दृष्टि की एक किस्म सक्षम है पारंपरिक macroscale तकनीक के साथ संभव हो गया.
यहाँ, हम एक endothelialized के निर्माण के लिए एक दृष्टिकोण पेश microchannels-a-चिप पर विवो microvessels में से 3 डी ज्यामिति mimics और photolithographic reflowable photoresist तकनीक, मुलायम लिथोग्राफी, और microfluidics के संयोजन का उपयोग करके नियंत्रित निरंतर छिड़काव प्रवाह के अंतर्गत चलाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
1. मास्टर ढालना निर्माण
संवहनी morphometry के लिए डिजाइन और मार्गदर्शक सिद्धांतों में से एक नेटवर्क भर पोत व्यास का वितरण न्यूनतम ऊर्जा ध्यान से नियंत्रित होता है कि जिसमें कहा गया है मूर्रे कानू?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध आंशिक रूप से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF 1227359), क्रमश: राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (ईपीएस-1003907), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (1007978) द्वारा प्रायोजित WVU अग्रिम कार्यालय, और WVU PSCoR द्वारा वित्त पोषित WVU EPSCoR कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था. microfabrication काम WVU साझा रिसर्च सुविधाएं (cleanroom सुविधाएं) और पश्चिम वर्जीनिया विश्वविद्यालय में चिप प्रयोगशाला (माइक्रोचिप लैब) पर Microfluidic एकीकृत सेलुलर अनुसंधान में किया गया था. confocal इमेजिंग WVU माइक्रोस्कोप इमेजिंग सुविधा पर किया गया था.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
Referências
- Adair, T. H. . Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , (2011).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
- Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , 65-87 (2006).
- Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
- Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
- Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
- Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , (2008).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
- Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
- Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
- Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
- Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
- Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray’s law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
- Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
- LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
- Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray’s law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
- Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
- Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
- Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
- Young, B., Heath, J. W. . Wheater’s functional histology: A text and colour atlas. , (2000).
- O’Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
- Elias, H. G. . An Introduction to Polymer Science. , (1997).
- Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
- Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
- Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
- Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
- Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
- Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
- Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104 (17), 1994-1995 (2001).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
- Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
- Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
- Darland, D. C., D’Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
- Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
- Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
- Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
- Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
- Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human “angiogenesis” assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
- Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
- Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
- Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
- Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).
