可逆小分子またはバイオセンサー応用のためのマルチコンポーネント構造を固定化するために、マイクロ流体オンチップキャプチャ - 環化反応
Summary
我々は、順次、オンチップバイオ直交環化学と抗体抗原取り込みを使用して、低分子の急速な可逆固定化および表面プラズモン共鳴（SPR）の研究のための官能化ナノ粒子集合体のための手法を提案する。
Abstract
配向および固定化密度を制御有する生物活性小分子の迅速な表面固定化のための方法は、バイオセンサー、マイクロアレイの用途に非常に望ましい。本研究では、TCO / TZ-誘導体化分子のマイクロ流体の固定化を可能にするために非常に効率的な共有結合性バイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）の間[4 +2]環化反応および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）を使用する。我々は、表面プラズモン共鳴（SPR）を用いて連続流条件下で、リアルタイムでプロセスを監視する。可逆的な固定化を可能にし、センサ表面の実験範囲を拡張するために、我々は、付加環化反応と非共有結合抗原 – 抗体捕捉成分を結合する。交互にセンサ表面にTCOまたはTzの部分を提示することによって、複数の捕獲 – 環化のプロセスは、多成分構造体の様々なオンチップ·アセンブリとの相互作用の研究のために一つのセンサー表面上に今や可能である。私たちは、私バイオセンサーチップ上に2つの異なる固定化実験で、この方法をllustrate、小分子、FK506結合タンパク質12（FKBP12）に結合AP1497と同じ低分子固定化され、 その場官能化ナノ粒子中の一部として。
Introduction
効率的な結合反応は、バイオテクノロジーの様々なアプリケーションのために表面に生物活性分子を付着させるための貴重なツールです。最近では、非常に高速なバイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）間の[4 +2]環化反応は、細胞表面、細胞内構造、抗体およびナノ粒子を標識するために使用されてきた1。 – 7ここでは、表面プラズモン共鳴（SPR）相互作用分析のための多成分構造の可逆オンチップ合成のために、抗原/抗体捕捉（GST /抗GST）との組み合わせで、[4 +2]付加環化反応を使用してモニターリアルタイムでのプロセス（ 図1）。8,9特に、キャプチャ付加環化戦略が確立されたプロトコルを使用して表面の再生を可能にします。8結果として、新たなアッセイの様々なリガンドの向きや密度を制御して安定したセンサ面の集合体フォーマットが可能になりました。使い方この戦略は、我々は、TCO / TZ-誘導体化小分子の固定化を実証し、バッファの様々な条件で環化率を特徴づける。我々は、直接、固定化GST抗原に結合した場合、キャプチャ·環戦略がその標的と相互作用する低分子の能力を保持していることを確認するために、一例として、FKBP12 10-12結合しFKBP12分子AP1497の間のよく知られた相互作用を選びましたまたは固定化ナノ粒子（NPS）へ。
この方法は、いくつかの利点があります。まず、センサーチップ上の小分子の可逆的な固定化が可能になりました。第二に、低分子のTCO / Tzの固定化にも標準的なSPRの研究の方向を逆転させるラベルフリー相互作用の研究を可能にし、結合相互作用の補完的なビューを提供することがあります。第三に、この方法は、標的化ナノ粒子のマイクロ流体合成、およびそれらのバインディンの即時評価を可能G特性。これは、標的化ナノ粒子の評価又はスクリーニングの効率を向上させ、また必要なナノ粒子の量を減少させることを約束する。13-15第四に、このアプローチは、連続流の下でリアルタイムにバイオ直交付加環化反応の反応速度を測定することができる。最後に、TCO / Tzの固定化化学は、血清の存在下でロバストである。一緒になって、我々は、この汎用性の高いアプローチが広くin vitroおよびin vivoの携帯アプリケーションでの関連性のマイクロ流体研究の多種多様な安定したセンサ面の構築を容易にすることを期待しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するキャプチャ付加環化の方法は、ラベルフリーチップベースの相互作用および動力学的研究のための修飾ナノ粒子および小分子を迅速に、可逆的な固定化を可能にします。固定化プロトコルは、<小分子リガンドの10μMの濃度を必要数分で行うことができる。リガンド濃度と接触時間の固定化密度を調節することにより厳密に制御することができる。我々のデータは、オンチッ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、NIHから（NHLBI契約番号HHSN268201000044C RW、SHおよびSYSに）資金を認めている。
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
Referências
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
