Mikroflödes On-chip Capture-cykloadditionsreaktion att reversibelt Immobilisera små molekyler eller flerkomponent Strukturer för Biosensor Applications
Summary
Vi presenterar en metod för snabb, reversibel immobilisering av små molekyler och funktionnanopartiklar församlingar för ytplasmonresonans (SPR) studier, med hjälp av sekventiell on-chip bioorthogonal cykloadditionen kemi och antikropp-antigen-capture.
Abstract
Metoder för snabb yta immobilisering av bioaktiva små molekyler med kontroll över riktning och immobilisering densitet är mycket önskvärt för biosensor och microarray applikationer. I denna studie använder vi en mycket effektiv kovalent bioorthogonal [4 +2] cykloadditionsreaktion mellan trans cyklookten (TCO) och 1,2,4,5-tetrazin (Tz) för att göra det möjligt för mikroflödes immobilisering av TCO / Tz-deriverade molekyler . Vi övervakar processen i realtid under kontinuerliga flödesförhållanden med hjälp av ytplasmonresonans (SPR). För att möjliggöra reversibel immobilisering och utvidga den experimentella intervallet sensorytan kombinerar vi en icke-kovalent antigen-antikroppsinfångningskomponenten med cykloadditionsreaktionen. Genom att växelvis presentera TCO eller Tz delarna till sensorytan, flera capture-cykloadditionsreaktioner processer är nu möjligt på en sensoryta för on-chip montering och interaktionsstudier av olika strukturer flera komponenter. Vi illustrate denna metod med två olika immobilisering experiment på ett biosensorchip, en liten molekyl, AP1497 som binder FK506-bindande protein 12 (FKBP12), och samma liten molekyl som en del av en immobiliserad och in situ-funktionaliserade nanopartiklar.
Introduction
Effektiva konjugeringsreaktioner är värdefulla verktyg för att fästa bioaktiva molekyler till ytor för olika biotekniska tillämpningar. Nyligen har det mycket snabbt bioorthogonal [4 +2] cykloadditionsreaktion mellan trans cyklookten (TCO) och 1,2,4,5-tetrazin (Tz) använts för att märka cellytor, subcellulära strukturer, antikroppar och nanopartiklar 1. – 7 Här använder vi [4 +2] cykloadditionsreaktion i kombination med antigen / antikropps capture (GST / anti-GST) för reversibel on-chip syntes av strukturer flerkomponents för ytplasmonresonans (SPR) interaktionsanalys och övervaka processen i realtid (figur 1). 8,9 Särskilt möjliggör avskiljning-cykloadditionen strategi yta regeneration med hjälp av ett etablerat protokoll. 8 Som en följd, montering av stabila sensorytor med kontroll över ligand orientering och densitet för olika nya analysen format är nu möjligt. Användadenna strategi vi visar immobilisering av TCO / Tz-derivatiserade små molekyler och karakterisera cykloadditionsreaktioner satser i en mängd olika buffertbetingelser. Vi valde den välkända växelverkan mellan FKBP12 och en molekyl AP1497 som binder FKBP12 10-12 som ett exempel för att kontrollera att den fångst-cykloadditionen strategi bevarar möjligheten för den lilla molekylen att interagera med sitt mål när antingen direkt ansluten till immobiliserade GST antigener eller till immobiliserade nanopartiklar (NPS).
Denna metod har flera fördelar. För det första är det nu möjligt att reversibel immobilisering av små molekyler på sensorchips. För det andra, TCO / Tz immobilisering av små molekyler kan också märkningsfria interaktionsstudier som omvänd orientering kanoniska SPR studier, och kan ge en kompletterande bild av en bindande interaktion. För det tredje tillåter denna metod mikroflödes syntes av riktade nanopartiklar, och omedelbar utvärdering av deras binding egenskaper. Detta lovar att effektivisera utvärdering eller screening riktade nanopartiklar, och även minska mängden av nanopartiklar som krävs. 13-15 fjärde kan detta tillvägagångssätt mäta reaktions kinetik bioorthogonal cykloadditionsreaktioner i realtid under kontinuerligt flöde. Slutligen är TCO / Tz immobilisering kemi robust i närvaro av serum. Sammantaget räknar vi med att denna mångsidiga tillvägagångssätt i stort sett kommer att underlätta byggandet av stabila sensorytor för en mängd olika mikroflödes studier med relevans för in vitro och in vivo cellulära applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fångst-cykloadditionen metod som beskrivs här möjliggör snabb, reversibel immobilisering av modifierade nanopartiklar och små molekyler för etikett-fri chip-baserad interaktion och kinetiska studier. Immobiliseringen protokoll kan utföras på några minuter som kräver <10 pM koncentrationer av småmolekylära ligander. Genom att modulera ligand koncentration och kontakttid immobilisering tätheter kan kontrolleras noga. Våra data visar att on-chip bioorthogonal reaktioner bevara möjligheten för in situ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner finansiering från NIH (NHLBI Kontrakt nr HHSN268201000044C att RW, SH och SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
Referências
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
