Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki
Summary
Biz sıralı on-chip bioorthogonal Siklokatılma kimya ve antikor-antijen yakalama kullanarak, küçük moleküllerin hızlı, geri dönüşümlü immobilizasyon ve Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) çalışmaları için işlevselleştirilen nanoparçacık meclisleri için bir yöntem mevcut.
Abstract
Yönlendirme ve immobilizasyon yoğunluğu üzerinde kontrol ve biyolojik olarak aktif küçük moleküllerin hızlı yüzey hareketsizleştirilmesi için yöntemler biyosensör ve mikro-dizi uygulamalar için oldukça tercih edilir. Bu çalışmada, TCO / TZ-türevli moleküllerin mikroakışkan immobilizasyon sağlamak için son derece verimli bir kovalent bioorthogonal trans-siklookten (TCO) arasında [4 +2] siklo reaksiyon ve 1,2,4,5-tetrazin (TZ) kullanın . Biz, yüzey plazmon rezonans (SPR) kullanılarak sürekli akış koşulları altında, gerçek zamanlı olarak işlem izler. Geri immobilizasyon sağlamak ve sensör yüzeyinin deneysel aralığını genişletmek için, ile siklo ilave reaksiyonu, bir kovalent olmayan bir antijen-antikor yakalama bileşeni birleştirir. Alternatif olarak sensör yüzeyine TCO veya Tz parçaları sunarak, birden çok yakalama-siklo işlemleri, çok-bileşenli yapıların çeşitli yonga montaj ve etkileşim çalışmaları için, bir sensor yüzeyi üzerinde artık mümkün. Biz i, küçük molekül, FK506 bağlayıcı protein 12 (FKBP12) bağlanan AP1497,, iki, bir biyo-algılayıcı çip üzerinde farklı hareketsiz kılma deneyleri ile bu yöntemi llustrate ve aynı küçük molekül, bir hareketsiz kılınmış ve in situ işlevselleştirilmiş nanoparçacık parçası olarak kullanılabilir.
Introduction
Etkili dönüşüm reaksiyonları biyoteknoloji çeşitli uygulamalar için yüzeylerine biyoaktif moleküllerin bağlanması için değerli araçlardır. Son zamanlarda, çok hızlı bioorthogonal trans-siklookten (TCO) arasında [4 +2] siklo-ilave reaksiyonu ve 1,2,4,5-tetrazin (Tz) hücre yüzeyleri, alt-hücresel yapılar, antikorlar ve nanopartiküller etiketlemek için kullanılmıştır: 1. – Burada 7, biz Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) etkileşim analizi için çok bileşenli yapıların geri çip üzerinde sentezi için, antijen / antikor yakalama (GST / anti-GST) ile kombinasyon içindeki [4 +2] siklo-ilave reaksiyonu kullanmak ve monitör gerçek zamanlı olarak işlem (Şekil 1). yeni deneyinin çeşitli ligand yönelim ve yoğunluğu üzerinde kontrol ve stabil sensor yüzeylerinin bir sonucu olarak, montaj olarak 8,9 Kayda değer şekilde, yakalama-siklo strateji kurulu bir protokol kullanılarak yüzey yenilenme sağlar. 8 biçimleri artık mümkün. KullanmaBu strateji, biz TCO / Tz türetilmemiş küçük moleküllerin immobilizasyon göstermek ve tampon koşulları çeşitli siklo oranları karakterize eder. Bu, ya doğrudan hareketsiz antijenlere GST bağlandıklarında yakalama-siklo stratejisi hedefiyle etkileşim için küçük molekülün yeteneğini korur doğrulamak için bir örnek olarak FKBP12 10-12 bağlanan terimi, FKBP12'nin ve bir molekül AP1497 arasında iyi bir etkileşime seçtik ya da hareketsiz nanopartiküller (NPS).
Bu yöntem çeşitli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, sensör çipi küçük moleküllerin geri dönüşümlü hareketsiz mümkündür. İkinci olarak, küçük moleküllerin TCO / Tz hareketsizleştirici da kurallı SPR çalışmalar yönünü tersine etiketi içermeyen etkileşim çalışmaları sağlayan ve bağlayıcı bir etkileşim tamamlayıcı bir görünüm sağlayabilir. Üçüncü olarak, bu yöntem, hedefli nanopartiküllerin mikroakışkan sentezini ve bunların bağlanma özelliğinin hemen değerlendirilmesini sağlarg özellikleri. Bu, hedefli nanopartiküller değerlendirilmesi ya da tarama verimliliğini artırmak ve aynı zamanda gerekli nanopartiküllerin miktarlarını azaltmak için söz. Dördüncü 13-15, bu yöntem sürekli akışı altında, gerçek zamanlı olarak bioorthogonal siklo reaksiyonların reaksiyon kinetiği ölçebilir. Son olarak, TCO / Tz immobilizasyon kimya serum mevcudiyetinde sağlamdır. Birlikte ele alındığında, bu çok yönlü yaklaşım, genel olarak in vitro ve in vivo hücre uygulamalarında alaka ile mikroakışkan çalışmaları geniş bir yelpazede için kararlı sensör yüzeylerinin yapımını kolaylaştırmak olacağını tahmin ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yakalama-siklo yöntemi etiket içermeyen yonga bazlı etkileşim ve kinetik çalışmalar için modifiye edilmiş nano ve küçük moleküller, hızlı, tersine çevrilebilir immobilizasyon sağlar. Hareketsizleştirme protokol <küçük moleküllü ligandlann 10 uM konsantrasyonlarda gerektiren dakika içinde gerçekleştirilebilir. Ligand konsantrasyonu ve temas süresi hareketsizleştirme yoğunluklara modüle tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilebilir. Verilerimiz çip üzerinde bioort…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz NIH (UKAKE Kontrat No HHSN268201000044C, SH ve SYS RW) fon kabul.
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
Referências
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
