Culturing ושמירה<em> Difficile Clostridium</em> בסביבת אנאירובית

Summary

difficile Clostridium הוא חיידק פתוגניים שהוא anaerobe מחמיר וגורם לשלשול לאנטיביוטיקה קשור (AAD). כאן, שיטות לבידוד, culturing ושמירה על ג תאים של צמח difficile ונבגים מתוארים. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר דורשת תחזוקה שוטפת על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי טיפוח difficile.

Abstract

difficile Clostridium הוא אנאירובי, חיידק גראם חיובי, sporogenic שאחראי בעיקר לשלשולי אנטיביוטיקה משויכים (AAD), והוא הפתוגן nosocomial משמעותי. ג difficile קשה לשמצה לבודד ולטפח והוא מאוד רגיש אפילו רמות נמוכות של חמצן בסביבה. כאן, שיטות לבידוד ג difficile מדגימות צואה ולאחר מכן culturing ג difficile להכנה של מניות גליצרול עבור אחסון לטווח ארוך מוצגים. טכניקות להכנה וספירת מניות נבג במעבדה עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים מחקרי מיקרוסקופיה ובעלי החיים גם מתוארות. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר שומר על סביבת אנאירובי עקבית על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי צמיחת difficile. אנו מספקים פרוטוקולים להעברת חומרים בתוך ומחוץ לחדר בלי caבאמצעות זיהום חמצן משמעותי יחד עם הצעות לתחזוקה שוטפת הנדרשת כדי לקיים את סביבת אנאירובי המתאימה לג יעיל ועקבי טיפוח difficile.

Introduction

difficile Clostridium הוא, חיידק יוצר נבג גראם חיובי שהוא anaerobe לחייב והפתוגן במערכת העיכול שעלול להיות קטלני לבני אדם ובעלי חיים. תאר בשנת 1935 תחילה כאורגניזם commensal נמצא בדגימות צואה מיילודים ^1, ג difficile מאוחר יותר הוכיח להיות הסוכן סיבתי של קוליטיס pseudomembranous הקשורים לטיפול אנטיביוטי ^2. ג זיהומי difficile (CDI) הם קדמו בדרך כלל על ידי טיפול אנטיביוטי שתוצאת שיבוש הפלורה הנורמלית במעי הגס, יצירת נישה לג difficile לשגשג ^2. ג difficile מועבר כנבג רדום דרך מסלול הצואה, אוראלי ולאחר מכן נובט בתוך מערכת העיכול, בייצור תאים של צמח מסוגל לייצר כמה רעלים וגורמים למחלת קוליטיס ³ חמורות. CDI הוא לעתים קרובות עקשן לטיפולים קונבנציונליים והן באלהfections לעתים קרובות חוזרים על עצמם ^4. כתוצאה מכך, CDI אחראי לעד 4.8 מליארד דולרים בעלויות טיפול רפואי בארצות הברית ^5-7.

ג difficile רגיש מאוד אפילו לרמות נמוכות של חמצן בסביבה. לג difficile להתמיד בסביבה ולהיות מועבר ביעילות ממארח ​​למארח, היווצרות נבג מטבולית פעיל היא ⁸ קריטיים. בגלל תחזוקת המעבדה ומניפולציה של ג difficile דורש סביבה מבוקרת, אנאירובי, טכניקות אלה מחייבות שימוש בתא אנאירובי. שימוש בתאים אנאירוביים הביאה התאוששות ובידוד של אנאירוביים לחייב ^9-11 מוגבר, ואפשר מספר הטכניקות מולקולריות שיש לבצע באווירה אנאירובית.

בנוסף לג difficile, שימוש אנאירובי קאמרי והתחזוקה המתוארת כאן חליםלאנאירוביים לחייב אחרים, כגון מינים אחרים קלוסטרידיאל (למשל perfringens ג), מינים אחרים במערכת העיכול (מינים למשל Bacteroides ¹²⁾ ופתוגנים חניכיים (למשל מיני Peptostreptococcus ^13).

Protocol

שים לב: ג difficile הוא פתוגן אדם ובעלי החיים שיכולים לגרום למחלות במערכת העיכול. ניסויים מעורבים ג difficile חייבת להתבצע עם אמצעי זהירות מתאים בטיחות ביולוגית (BSL-2). 1. אנאירובי קאמרי שימוש ותחזוקה <p class="jove_content" style=";text-align:right;direc…

Representative Results

דוגמא של ג difficile גדל על BHIS ותקשורת כבשים אנאירובי קולומביה אגר דם שניתן לראות באיור 2. ג difficile יוצר מושבות סדירות שהם שטוחים ובעלי מראה קרקע זכוכית אשר באו לידי ביטוי בשני אמצעי התקשורת. הנה, לבודד קליני אריתרומיצין רגיש של ג difficile, 630E 30, הוא…

Discussion

השיטות שתוארו כאן לאפשר התאוששות פשוטה ומהירה של ג difficile ממגוון רחב של דגימות צואה, כולל בני אדם, עכברים ואוגרים, כמו גם האחסון לטווח הארוך של ג difficile כמו מניות גליצרול או נבג. ג difficile יכול להיות אורגניזם קשה לעיבוד, אך הקפדה על סביבת אנאירובי והיישום של ט?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Proteose Peptone no. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhydrous)	Fisher	M65
ᴅ-Fructose	Fisher	L96
Sodium taurocholate	Sigma	T4009
ᴅ-cycloserine	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Brain heart infusion medium	BD	237300
Proteose Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cysteine	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Columbian sheep blood agar	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Sterile inoculating loops	Fisher	22363596
Sterile swabs	Fisher	1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories	Coy Laboratory Products, Inc	Customer Specified	These items are custom ordered per laboratory needs
			Materials
			TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.