की बातचीत का अध्ययन<em> स्ताफ्य्लोकोच्चुस</em> फ्लो और समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा न्यूट्रोफिल साथ
Summary
हम द्वारा स्रावित PSMs और अन्य विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के तरीकों को पेश<em> स्ताफ्य्लोकोच्चुस</em> प्रवाह और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग जीवाणुओं पर.
Abstract
हम जीवाणुओं पर स्ताफ्य्लोकोच्चुस द्वारा उत्पादित और स्रावित फिनोल घुलनशील modulins (PSMs) और अन्य विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के तरीकों को प्रस्तुत करते हैं. हम घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग कर नए सिरे से जीवाणुओं को अलग जीवाणुओं पर PSMs के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए. इन जीवाणुओं कैल्शियम जुटाने पर fluoresces कि एक डाई के साथ लोड कर रहे हैं. PSMs द्वारा neutrophils के सक्रियण मुक्त intracellular कैल्शियम एकाग्रता में एक तेजी से और क्षणिक वृद्धि शुरू की. एक प्रवाह cytometry प्रयोग में यह तेजी से जुटाना मुक्त 2 सीए की वृद्धि की एकाग्रता + करने के लिए प्रतिक्रिया करता है कि एक पूर्व लोड डाई प्रतिदीप्ति की निगरानी के द्वारा मापा जा सकता है. इस पद्धति का उपयोग हम न्युट्रोफिल को सक्रिय करने, और न्युट्रोफिल सक्रियण के विशिष्ट और सामान्य inhibitors के प्रभाव को मापने के लिए आवश्यक पी एस एम एकाग्रता का निर्धारण कर सकते हैं.
इंट्रासेल्युलर अंतरिक्ष, w में PSMs की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिएई GFP के लिए PSMα operon के प्रमोटर के संवाददाता fusions के निर्माण किया है. जब एस के इन रिपोर्टर उपभेदों ऑरियस neutrophils द्वारा phagocytosed रहे हैं, अभिव्यक्ति की प्रेरण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर देखा जा सकता है.
Introduction
न्यूट्रोफिल (PMNs) स्ताफ्य्लोकोच्चुस 1 खिलाफ सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि पेशेवर phagocytes हैं. मेजबान और सूक्ष्म जीव के बीच निरंतर लड़ाई दोनों के हथियारों की दौड़ के लिए प्रेरित किया. Meticillin प्रतिरोधी एस की हाल ही में, समुदाय जुड़े (सीए) उपभेदों (MRSA) aureus न्युट्रोफिल हत्या 2,3 की तरक़ीब में बहुत कुशल होने लगते हैं कि उभरा है. सीए मरसा के अत्यधिक फिनोल घुलनशील modulin (PSMs) उत्पादन 4,5 उच्च डाह के साथ संबद्ध किया गया है. मानव जीवाणुओं रिसेप्टर 6 युग्मित इस जी प्रोटीन की सक्रियता के लिए नेतृत्व जो FPR2 के माध्यम से इन PSMs को पहचान सकते हैं. जल्द से जल्द घटनाओं में से एक कैल्शियम के intracellular दुकानों (सीए 2 +) की जुटाना है. सीए 2 + degranulation और phagocytosis 7 सहित PMNs की प्रेरक कार्यों की एक किस्म के लिए एक माध्यमिक दूत के रूप में कार्य करता है. इसलिए सीए 2 + की एक बहुत ही संवेदनशील सूचक हैPMNs सक्रिय करने के लिए PSMs की कार्य क्षमता. जीवाणुओं पर PSMs के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, ताजा neutrophils, कैल्शियम जुटाने पर fluoresces कि एक रंग के साथ अलग और लोड कर रहे हैं. एक प्रवाह cytometry प्रयोग में यह तेजी से जुटाना मापा जा सकता है. इस विधि का प्रयोग, यह जीवाणुओं को विषाक्त और अन्य घटकों का प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन, और इन सक्रिय कर रहे हैं, जिस पर सबसे कम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए संभव है. हमारे लिए, यह एस द्वारा उत्पादित कई प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है ऑरियस ऐसे FPR2 निरोधात्मक प्रोटीन (FLIPr) 8, 7 FLIPr की तरह, और Staphylococcus aureus (चिप्स) 9 की Chemotaxis निरोधात्मक प्रोटीन के रूप में प्रतिरक्षा चोरी, में शामिल किया गया. इन सभी प्रोटीन एगोनिस्ट पहचानने रिसेप्टर के बंधन से neutrophils में कैल्शियम जुटाना बाधित करने के लिए दिखाया गया है.
हाल ही में, हमारे समूह PSMs कार्यात्मक 10 सीरम लिपो प्रोटीन से हिचकते हैं कि वर्णित किया गया है </> समर्थन. इन लिपो प्रोटीन PSMs मुख्यतः इंट्रासेल्युलर वातावरण में उनके कार्य डालती यह दर्शाता है कि रक्त और मानव ऊतक के भीतर बहुतायत से मौजूद हैं. कैल्शियम जुटाना परख की उपलब्धता हमें ठीक सीरम की बहुत कम मात्रा से काफी निषेध ने संकेत दिया PSMs द्वारा neutrophils के सक्रियण, पर सीरम लिपो प्रोटीन के प्रभाव को मापने के लिए अनुमति दी.
PSMs कार्यात्मक सीरम से हिचकते रहे हैं, हम किसी कोशिका के अंदर विषाक्त पदार्थों के रूप में PSMs के लिए एक महत्वपूर्ण कार्य है कि वहाँ धारणा है. इसलिए हम phagocytosis के बाद PSMs की भूमिका निर्धारित करने की मांग की. कहनेवाला अंतरिक्ष में PSMs की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, हम GFP के लिए psmα operon के प्रमोटर के संवाददाता fusions के निर्माण किया है. जब एस के इन रिपोर्टर उपभेदों ऑरियस neutrophils द्वारा phagocytosed थे, अभिव्यक्ति की प्रेरण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 10 का उपयोग नमूदार था. जाहिर है, इस technique एस में जीन की एक बड़ी संख्या की अभिव्यक्ति के अध्ययन की अनुमति देता है phagocytosis के बाद ऑरियस या अन्य रोगजनकों. एस के बाद से कहनेवाला आला में जीवित ऑरियस इस आला में सक्रिय जीन की भूमिका का अध्ययन, सहज प्रतिरक्षा प्रणाली 11 10 12 काबू पाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है अपने डाह को समझने के लिए प्रासंगिक है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित तरीकों में कुछ कदम बहुत महत्वपूर्ण हैं. हम यहां इन पर प्रकाश डाला जाएगा.
घनत्व ढाल centrifugation द्वारा neutrophils के अलगाव के लिए यह centrifugation कदम के दौरान या बाद परतों को परेशान नहीं करने के लिए मह?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Molecular Probes / Life Technologies | F-1241 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | density 1.077 g/ml |
| Histopaque | Sigma | 11191 | density 1.119 g/ml |
| RPMI 1640 | Gibco, Life Technologies | 52400-025 | contains 25 mM HEPES and L-glutamine |
| Leica TCS SP5 microscope | Leica Microsystems, The Netherlands | TCS SP5 | objective: HCX PL APO 40X/0.85 |
| FACSCalibur | BD Biosciences | FACSCalibur | Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process |
Referências
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