Studere Interaktioner af<em> Staphylococcus aureus</em> Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Microscopy

Summary

Vi præsenterer metoder til at undersøge effekten af ​​PSM'er og andre toksiner udskilt af<em> Staphylococcus aureus</em> På neutrofiler ved hjælp af flowcytometri og fluorescens mikroskopi.

Abstract

Vi præsenterer metoder til at undersøge effekten af phenol opløselige modulins (PSM'er) og andre toksiner produceres og udskilles af Staphylococcus aureus på neutrofiler. At studere virkningerne af PSM'er på neutrofiler vi isolerer friske neutrofiler hjælp densitetsgradientcentrifugering. Disse neutrofiler er fyldt med et farvestof, der fluorescerer ved calciummobilisering. Aktiveringen af ​​neutrofiler ved PSM'er indleder en hurtig og forbigående stigning i den frie intracellulære calciumkoncentration. I en flowcytometri eksperiment denne hurtig mobilisering kan måles ved overvågning af fluorescensen af et præ-loadet farvestof, der reagerer på den forøgede koncentration af frit ^{Ca2 +.} Med denne metode kan vi bestemme PSM nødvendige koncentration for at aktivere neutrofile, og måle effekten af ​​specifikke og generelle inhibitorer af neutrofil aktivering.

For at undersøge ekspressionen af ​​PSM'erne i intracellulære rum, we har konstrueret reporter fusioner af initiativtagerne til PSMα operon til GFP. Når disse reporter stammer af S. aureus er fagocyteret af neutrofiler, kan induktionen af ekspression observeret ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

Introduction

Neutrofile (PMN'er) er professionelle fagocytter, der spiller en central rolle i det medfødte immunforsvar mod Staphylococcus aureus ^1.. Den konstante kamp mellem vært og mikrobe har ført til et våbenkapløb af begge. Senest EF-associerede (CA) stammer af meticillin resistente S. aureus (MRSA) er dukket op, synes at være meget effektive i omgåelse af neutrofile drab ^2,3. Overdreven phenol opløselig modulin (PSM'erne) fremstilling af CA-MRSA er blevet forbundet med højere virulens ^4,5. Humane neutrofiler kan genkende disse PSM'er via FPR2 som fører til aktivering af denne G-protein koblet receptor ^6.. En af de tidligste begivenheder mobilisering af intracellulære lagre af calcium (Ca ^{2 +). Ca2 +} virker som en sekundær budbringer for en række effektorfunktioner PMN'er herunder degranulering og fagocytose ^7.. Derfor Ca ^{2 +} er en meget følsom indikator forfunktionsevne af PSM'er at aktivere PMN'er. At undersøge virkningerne af PSM'er på neutrofiler, er friske neutrofiler isoleres og fyldt med et farvestof, som fluorescerer ved calciummobilisering. I et flowcytometri eksperiment denne hurtig mobilisering kan måles. Ved hjælp af denne metode, er det muligt at studere de direkte virkninger af toksiske og andre komponenter på neutrofiler, og bestemme den laveste koncentration, hvor disse er aktive. For os er det et meget nyttigt redskab til at undersøge effekten af mange proteiner produceret af S. aureus er involveret i immun unddragelse, såsom FPR2 inhiberende protein (FLIPR) ^8, FLIPR-lignende ^7, og Kemotaksi hæmmende protein af Staphylococcus aureus (spåner) ^9.. Alle disse proteiner har vist sig at hæmme calciummobilisering i neutrofiler ved binding til receptoren anerkende agonist.

For nylig har vores gruppe beskrevet, at PSM'er funktionelt hæmmes af serumlipoproteiner ^{10 <}/ Sup>. Disse lipoproteiner er rigeligt til stede i blod og humant væv, hvilket indikerer, at PSM'er udøve deres funktion primært i det intracellulære miljø. Tilgængeligheden af ​​calciummobilisering assayet tilladt os at præcist at måle effekten af ​​serumlipoproteiner på aktivering af neutrofiler af PSM'er angivet ved betydelig hæmning af meget lave koncentrationer af serum.

Eftersom PSM'er funktionelt inhiberes af serum, vi antager, at der er en vigtig funktion for PSM'er som intracellulære toksiner. Vi har derfor forsøgt at fastlægge den rolle PSM'er efter fagocytose. For at undersøge ekspressionen af PSM'erne i intercellulære rum, vi har opbygget reporter fusioner af initiativtagerne til psmα operon til GFP. Når disse reporter stammer af S. aureus blev fagocyteret af neutrofiler, blev induktionen af udtrykket observerbare hjælp fluorescensmikroskopi ^10.. Naturligvis er denne technique tillader undersøgelse af ekspressionen af et stort antal gener i S. aureus eller andre patogener efter fagocytose. Eftersom for S. aureus overleve i intercellulære niche er meget vigtigt at overvinde det medfødte immunsystem ^{11 10 12,} studere rollen af gener aktiveres i denne niche er yderst relevant for forståelsen af virulens.

Protocol

1.. Isolering af PMNs af menneskeblod ved massefyldecentrifugering Tegn 5 9 ml rør af hepariniseret veneblod. Forbered dual layer Ficoll gradienter (4 gradienter for 5 rør blod) som følger: Hæld 12 ml af en massefylde 1,119 g / ml Ficoll opløsning i et 50 ml rør og omhyggeligt lag 10 ml af en massefylde 1,077 g / ml Ficoll opløsning på toppen. Fortyndes blodet med et tilsvarende volumen PBS. Lag det fortyndede blod forsigtigt på dual layer Ficoll gradient, 20-25 ml pr gr…

Representative Results

Flowcytometrisk assay til vurdering af calciummobilisering i humane PMN'er Inkubering neutrofiler med en koncentration række syntetiske PSMα3 resulterer i hurtig aktivering som målt ved calciumflux, hvilket viser sig ved en stigning i signalet i FL-1. Præ-inkubering af syntetisk PSMα3 med 0,01%, 0,1% eller 1% humant serum inhiberede signifikant evnen til at fremkalde calcium flux (Figur 1). Analyse af GFP-ekspression i bakterier efter fagocyto…

Discussion

I de her beskrevne metoder nogle trin er meget kritisk. Vi vil fremhæve disse her.

Til isolering af neutrofiler ved densitetsgradientcentrifugering er det vigtigt ikke at forstyrre lagene under eller efter centrifugeringstrin. Når sugning neutrofilerne hjælp af en plastic pipette, så sørg for ikke at presse ballonen, mens i det lag af celler, vil så skubbe væske forstyrre lag. Også visuelt inspicere pelleten af ​​neutrofiler efter osmotisk chok og centrifugeringstrin. Hvis pellet…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process