Studeren Interacties van<em> Staphylococcus aureus</em> Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

Summary

We methode om het effect van PSMs en andere toxines uitgescheiden door bestuderen<em> Staphylococcus aureus</em> Op neutrofielen behulp van flowcytometrie en fluorescentie microscopie.

Abstract

We methode om het effect van fenol oplosbare modulins (PSMs) en andere toxinen geproduceerd en uitgescheiden door Staphylococcus aureus op neutrofielen bestuderen. Om de effecten van de PSMs op neutrofielen we isoleren verse neutrofielen behulp dichtheidsgradiëntcentrifugatie bestuderen. De neutrofielen worden geladen met een kleurstof die fluoresceert bij calcium mobilisatie. De activering van neutrofielen door PSMs initieert een snelle en voorbijgaande verhoging van de vrije intracellulaire calciumconcentratie. In een flow cytometrie experiment kan deze snelle mobilisatie gemeten door het volgen van de fluorescentie van een vooraf geladen kleurstof die reageert op de verhoogde concentratie vrije Ca ^{2 +.} Met deze methode kunnen we de PSM concentratie nodig om de neutrofielen activeren, en meet de effecten van specifieke en algemene remmers van de neutrofiel activatie bepalen.

Om de expressie van de PSMs onderzoeken in de intracellulaire ruimte, we reporter fusies van de promoter van het operon PSMα GFP geconstrueerd hebben. Wanneer deze reporter stammen van S. aureus gefagocyteerd door neutrofielen, kan de inductie van expressie worden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie.

Introduction

Neutrofielen (PMN's) zijn professionele fagocyten die een belangrijke rol spelen bij de aangeboren immuunrespons tegen Staphylococcus aureus ^1. De voortdurende strijd tussen gastheer en microbe heeft geleid tot een wapenwedloop van beide. Onlangs, community-geassocieerde (CA) stammen van meticilline resistente S. aureus (MRSA) naar voren zijn gekomen die lijken erg efficiënt te zijn in het omzeilen van neutrofielen doden ^2,3. Overmatige fenol oplosbaar modulin (PSMs) productie van CA-MRSA is geassocieerd met hogere virulentie ^4,5. Menselijke neutrofielen kunnen deze PSMs herkennen via FPR2 die leiden tot activering van deze G-eiwit gekoppelde receptor ^6. Een van de vroegste gebeurtenissen is de mobilisatie van intracellulaire opslagplaatsen van calcium ^{(Ca2 +).} Ca ^{2 +} fungeert als een tweede boodschapper voor verschillende effectorfuncties van PMNs waaronder degranulatie en fagocytose ^7. Daarom Ca ^{2 +} is een zeer gevoelige indicator van defunctionele capaciteit van PSMs aan PMN's te activeren. Om de effecten van PSMs op neutrofielen bestuderen, zijn verse neutrofielen geïsoleerd en geladen met een kleurstof die fluoresceert bij de mobilisatie van calcium. In een flowcytometrie experiment kan deze snelle mobilisatie worden gemeten. Met deze methode is het mogelijk om het directe effect van toxische en andere componenten op neutrofielen bestuderen en bepalen de laagste concentratie waarbij deze actief zijn. Voor ons, het is een zeer nuttig instrument om het effect van vele eiwitten geproduceerd door S. studeren aureus betrokken bij immuun ontduiking, zoals FPR2 remmend eiwit (FLIPR) ^8, FLIPR-achtige ^7, en Chemotaxis remmend eiwit van Staphylococcus aureus (CHIPS) ^9. Al deze eiwitten aangetoond dat het calcium mobilisatie neutrofielen remt door binding aan de receptor herkennen van de agonist.

Onlangs heeft onze groep beschreven die PSMs functioneel worden geremd door serum lipoproteïnen ^{10 <}/ Sup>. Deze lipoproteïnen zijn overvloedig aanwezig in het bloed en menselijk weefsel, wat aangeeft dat PSMs oefenen hun functie voornamelijk in de intracellulaire omgeving. De beschikbaarheid van calcium mobilisatie assay toegestaan ​​om het effect van serum lipoproteïnen nauwkeurig te meten bij activering van neutrofielen door PSMs, aangegeven door de aanzienlijke remming door zeer lage concentraties serum.

Aangezien de PSMs functioneel geremd door serum, veronderstelden we dat er een belangrijke functie voor PSMs als intracellulaire toxines. We hebben daarom getracht de rol van PSMs na fagocytose bepalen. Om de expressie van de PSMs in de intercellulaire ruimte te onderzoeken, hebben we reporter fusies van de promoter van het operon psmα GFP geconstrueerd. Wanneer deze reporter stammen van S. aureus werden gefagocyteerd door neutrofielen, werd de inductie van expressie waarneembaar met behulp van fluorescentie microscopie ^10. Uiteraard is deze technique maakt het onderzoek mogelijk van de expressie van een groot aantal genen in S. aureus of andere ziekteverwekkers na fagocytose. Aangezien voor S. aureus overleven in de intercellulaire niche is zeer belangrijk om het aangeboren immuunsysteem ^{11 10 12} overwinnen, het bestuderen van de rol van genen geactiveerd in deze niche is zeer relevant voor het begrijpen van de virulentie.

Protocol

1. Isolatie van PMN's uit menselijk bloed door dichtheidscentrifugeren Teken 5 9 ml tubes van heparine veneuze bloed. Bereid dual layer Ficoll gradiënten (4 gradiënten van 5 buisjes bloed) als volgt: Giet 12 ml van een dichtheid van 1,119 g / ml Ficoll-oplossing in een 50 ml buis en voorzichtig laag 10 ml met een dichtheid 1,077 g / ml Ficoll-oplossing geplaatst. Verdun het bloed met een gelijk volume PBS. Layer het verdunde bloed zorgvuldig op de dual layer Ficoll gradiën…

Representative Results

Flow cytometrische assay voor de beoordeling van calcium mobilisatie in menselijke PMN Incuberen neutrofielen met een concentratie reeks synthetische PSMα3 resulteert in snelle activering zoals gemeten door calcium flux, die blijkt uit een toename van het signaal FL-1. Pre-incubatie van synthetische PSMα3 met 0,01%, 0,1% en 1% menselijk serum remde het vermogen om calcium fluxen (figuur 1) opwekken. Analyse van GFP expressie in bacteriën na fagocyto…

Discussion

In de hier beschreven werkwijzen aantal stappen zeer kritisch. We zullen deze hier benadrukken.

Voor de isolatie van neutrofielen door dichtheidsgradiënt centrifugatie is het belangrijk om de lagen te verstoren tijdens of na de centrifugatiestappen. Wanneer opzuigen de neutrofielen met een plastic pipet, zorg ervoor dat niet aan de ballon te knijpen, terwijl in de laag van cellen, zal als het uitwerpen vloeistof de lagen te verstoren. Ook visueel de pellet van neutrofielen na de osmotische …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process