Изучение взаимодействий<em> Золотистый стафилококк</em> С нейтрофилами с помощью проточной цитометрии и микроскопии Длительная

Summary

Мы представляем методы для изучения эффект PSMs и других токсинов выделяемый<em> Золотистый стафилококк</em> На нейтрофилах использованием проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии.

Abstract

Мы представляем методы для изучения влияния фенола растворимые модулинов (PSMs) и другие токсины, вырабатываемые и выделяемые золотистый стафилококк на нейтрофилы. Для изучения влияния PSMs на нейтрофилы мы изолируем свежих нейтрофилов использованием центрифугирования в градиенте плотности. Эти нейтрофилы загружаются с красителем, который флуоресцирует при мобилизации кальция. Активацию нейтрофилов PSMs инициирует быстрое и кратковременное повышение в свободном внутриклеточной концентрации кальция. В эксперименте проточной цитометрии этой быстрой мобилизации может быть измерена путем мониторинга флуоресценции предварительно загруженных краситель, который реагирует на повышение концентрации свободного Ca2 ^+. С помощью этого метода можно определить PSM концентрации, необходимой для активации нейтрофилов и измерить эффекты конкретные и общие ингибиторы активации нейтрофилов.

Чтобы исследовать экспрессию PSMs в межклеточном пространстве, шэлектронной построили репортер слитых от промотора из PSMα оперон, чтобы GFP. Когда эти репортером штаммы S. стафилококк фагоцитированы нейтрофилах, индукция выражение может быть, наблюдаемые с помощью флуоресцентной микроскопии.

Introduction

Нейтрофилы (PMNs) профессиональные фагоциты, которые играют ключевую роль в врожденную иммунную ответ против золотистый стафилококк ^1. Постоянном битве между хоста и микроба привела к гонки вооружений того и другого. В последнее время сообществу-связанного (CA) штаммов Meticillin устойчивыми штаммами S. стафилококк (MRSA) появились, которые, кажется, очень эффективным в обход Совета нейтрофилом убийству ^2,3. Чрезмерные фенолом растворимые модулин (PSMs) производство CA-MRSA была связана с более высокими вирулентности ^4,5. Человека нейтрофилах могут распознать эти PSMs через FPR2, которые приводят к активация этого G-белком рецептор ^6. Один из самых ранних событий является мобилизацией внутриклеточного МАГАЗИНЫ кальция (Ca ^{2 +).} Са ^{2 +} выступает в качестве вторичного посланник для разнообразие эффекторных функций из PMNs в том числе дегрануляции и фагоцитоз ^7. Поэтому Ca ^{2 +} является очень чувствительным индикаторомфункциональную способность PSMs, чтобы активировать PMNs. Для изучения эффекты из PSMs на нейтрофилах, свежий нейтрофилы изолированы и загружается с краситель, который флуоресцирует на мобилизации кальция. В эксперименте по проточную цитометрию эту быстрой мобилизации может быть измерена. Используя этот метод, оно является возможным изучать прямые эффекты из токсичные и с другими компонентами на нейтрофилы, и определить самую низкую концентрация, при которой эти являются активными. Для нас это является очень полезный инструмент, чтобы изучения влияния многих белки, продуцируемые S. стафилококк, участвующих в иммунном уклонением, такие, как FPR2 ингибиторного белка (FLIPR) ^8, FLIPR-подобный ^+7, и Хемотаксис ингибиторного белка из золотистый стафилококк (CHIPS) ^9. Все эти белки, были показанный, чтобы ингибировать кальций мобилизация в нейтрофилах путем связывания с рецептор признавая агонистом.

В последнее время наша группа описано, что PSMs являются функционально ингибируются сывороточные липопротеины ^{+10 <}/ Вир>. Эти липопротеины в большом количестве присутствуют в пределах в кровь и человеческой ткани, указывая, что PSMs оказывают свое функция в первую очередь в внутриклеточный окружающую среду. Доступность из анализе мобилизацию кальция позволила нам точно измерить эффект из сывороточные липопротеины на активации нейтрофилах по PSMs, на что указывает значительный ингибирование с помощью очень низких концентрациях из сыворотке крови.

Так как PSMs являются функционально ингибируется при добавлении сыворотки к мы предположили, что там является важной функцией для PSMs как внутриклеточные токсинов. Поэтому мы стремились, чтобы определить роли PSMs после того, как фагоцитоза. Чтобы исследовать выражением PSMs в межклеточном пространстве, мы построили репортером слияний от промотора из psmα оперон, чтобы GFP. Когда эти репортером штаммы S. стафилококк были фагоцитированы нейтрофилах, индукция выражения мнения было наблюдаемыми с помощью флуоресцентной микроскопии ^+10. Очевидно, что эта TEChnique позволяет изучением выражение из большого числа из гены в S. стафилококк или других патогенами после того, как фагоцитоза. Так как для S. стафилококк выживших в межклеточном нишу очень важна, чтобы преодолеть врожденная иммунная система ^{11 10 12,} изучая роли генов активированы в этой нише является высоко, важной для понимания его вирулентность.

Protocol

1. Выделение PMNs из крови человека по центрифугирование в градиенте плотности Draw 5 9 мл пробирках из гепаринизированной венозной крови. Подготовьте двойной слой Ficoll градиенты (4 градиентов для +5 пробирки для крови) в качестве следующим образом: заливают 12 мл от плотности, +1,119 г /…

Representative Results

Проточной цитометрии анализе для оценки мобилизации кальция в человеческих PMNs Инкубирующие нейтрофилах с концентрацией серия из синтетический PSMα3 что приводит к быстрому активация как измерено кальций флюс, которая показана по увеличение в сигнале в FL-1. Предварительно…

Discussion

В способах, описанных здесь некоторых шаги очень критическим. Мы будем выделить эти здесь.

Для изоляции нейтрофилах центрифугированием в градиенте плотности оно имеет важное значение, чтобы не потревожить слои, во время или после того, как центрифугирование шагов. Когд?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process