Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em> Drosophila</em
Summary
In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster.
Abstract
Für viele Tiere, Hunger fördert Veränderungen im olfaktorischen System in einer Weise, die die Suche nach geeigneten Nahrungsquellen erleichtert. In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster. In einem lichtdichten Gehäuse mit rotem Licht, die unsichtbar für Fruchtfliegen ist beleuchtet, eine Kamera, um benutzerdefinierte Datenerfassungssoftware verknüpft überwacht die Position von sechs Fliegen gleichzeitig. Jede Fliege beschränkt sich auf in einzelnen Arenen, die eine Nahrungsmittelgeruch in der Mitte gehen. Die Testarenen ruhen auf einem porösen Boden, die Funktionen, um Geruch Ansammlung zu verhindern. Latenz, um die Geruchsquelle, eine Metrik, Geruchsempfindlichkeit unter verschiedenen physiologischen Zuständen spiegelt zu finden, wird von der Software-Analyse bestimmt. Hier diskutieren wir die kritische Mechanik der Ausführung dieses Verhaltens-Paradigma und decken spezifische Fragen der Fliege loading, Geruchsbelastung, Temperatur-Test, Datenqualität und statistische Analyse.
Introduction
Staaten von Hunger fördern zwei Arten von appetitive Verhalten: Nahrungssuche und der Nahrungsaufnahme ein. Diese einfache Verhaltenstest ist nützlich für die Untersuchung der chemotaktischen Verhalten mit Futter 2,3 verbunden. Insbesondere verfolgt sie fly Position, Laufgeschwindigkeit und Latenz auf der Suche nach einem Lebensmittelgeruch Ziel. Latenz von Lebensmitteln Stellung dient als Maß für die Messung von Veränderungen in der Empfindlichkeit des Fliegengeruchserkennungssystem stromabwärts von Änderungen im internen Zustand appetitive. Eine manuelle Version dieses Tests wurde zuvor verwendet, um zu zeigen GABA-B-Rezeptor-Signal ist für die Geruchslokalisierung Verhalten wichtig in der Erwachsenen 3 fliegt. Die aktuelle Version des automatisierten Test war maßgeblich an der Studie, wie kurz Neuropeptid-F (sNPF) Signalisierung formt die olfaktorischen Karte in Drosophila und Einflüsse appetitive Verhaltensweisen 2.
Tests in einem dunklen, Temperatur und Feuchtigkeit kontrollierten Raum erfolgen. DigitalVideokameras über den klaren Acryl-Testplatten gesetzt verfolgen Fliegen durch 660-nm-LED-Beleuchtung hinterleuchtet. Informationen von der Kamera in Echtzeit von einem Computer stationiert neben dem Testbereich verarbeitet. Wir verwenden Datenerfassungssoftware, die während der Testphase und speichert die Koordinaten der Flugpositionen.
In diesem Paradigma wird das Thema in einer Arena, die eine Nahrungsmittelgeruch in der Mitte enthält freigesetzt; der Geruch Objekt schafft eine Nahrungsmittelgeruch Gradienten in der Arena, die Nahrungssuche in der Flugverhalten auslöst. Ein ähnlicher Geruch Suche Protokoll zu der Studie der Chemosensorik in einzelnen Drosophila-Larven 7 angewandt. Während andere Verhaltenstests, wie der Vier-Felder-Olfaktometer 4,5 oder dem T-Labyrinth 6 bewerten Geruchsaversion oder Anziehung Verhalten, wird dieses Paradigma besten geeignet, um Geruchsempfindlichkeit und Chemotaxis Verhalten zu beurteilen.
Mehrere wichtige Vorteile begleiten diese assay. Erstens ermöglicht sie schnelle Erfassung großer Datenmengen, da die Datenerhebung und-analyse sind meist automatisiert. Zweitens trennt dieser Test und misst das Verhalten von Einzellinie, wodurch soziale olfaktorische Signale, die ihr Verhalten beeinflussen können. Drittens, die Einfachheit des Protokolls und einfachen experimentellen Design machen den Test effizient und einfach, andere zu lehren.
Zusätzlich kann dieser Test verwendet werden, um weitere Sonde neuronalen Schaltkreise durch die Kombination mit der umfangreichen genetischen Toolkit zur Verfügung, um Drosophila melanogaster 8 zugrunde liegenden Nahrungssuchverhalten werden. Gezielte Expression von Transgenen, dass Schweigen zu erregen oder Neuronen können mit Tools wie der GAL4-UAS-System sowie der FH-shibire ts1, UAS-Tetanus-Toxin und UAS-TRPA1 (B) erreicht werden Transgene 12.09.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Lebensmittel-Suchverhalten Assay. Zusätzlich zu Lebensmitteln Gerüche, können aber auch für die Untersuchung des Fliegen Fähigkeit, andere Objekte zu lokalisieren Geruch angepasst werden. Zum Beispiel kann es zu der Studie von Mate-Lokalisierung Verhalten in männlichen Fliegen 3 angewendet werden Es gibt einige zusätzliche Überlegungen für dieses Protokoll, das wir zu diesem Verfahren hier zu erwähnen.:
<p class="jo…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien JWW aus dem National Institute of Health (R01DK092640) und der National Science Foundation (0920668) unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking–Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking–Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking–Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
Referências
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