Summary
Nós descrevemos um protocolo geral para no rastreamento de células in vivo utilizando ressonância magnética em um modelo de rato com ex vivo células marcadas. Um protocolo típico para a marcação de células, o processamento de aquisição de imagem e a quantificação é incluído.
Abstract
In vivo 19 F MRI permite o acompanhamento quantitativo de células sem o uso de radiação ionizante. É uma técnica não-invasiva, que pode ser aplicado aos seres humanos. Aqui, nós descrevemos um protocolo geral para marcação celular, imagem e processamento de imagem. A técnica é aplicável a vários tipos de células e modelos animais, embora aqui nos concentramos em um modelo típico do mouse para rastrear células do sistema imunológico murino. As questões mais importantes para a rotulagem de células são descritos, uma vez que estes são relevantes para todos os modelos. Do mesmo modo, os principais parâmetros de imagem são listados, embora os pormenores irão variar dependendo do sistema de ressonância magnética e a configuração do indivíduo. Finalmente, incluímos um protocolo de processamento de imagem para quantificação. Variações para esta e outras partes do protocolo, são avaliados na seção Discussão. Com base no procedimento detalhado descrito aqui, o usuário terá de adaptar o protocolo para cada tipo específico de célula, etiqueta de pilha, modelo animal, e configuração de imagem. Note-se que o protocolo também pode ser adaptado para uso humano, desde que sejam satisfeitas as restrições clínicos.
Introduction
Em rastreamento celular vivo é essencial para a otimização e monitoramento de terapias celulares 1. Devido à sua natureza não-invasiva, a imagem oferece excelentes oportunidades para monitorar as células in vivo. Imagem por Ressonância Magnética (MRI) é independente da radiação ionizante e permite uma resolução de imagem superior e contraste intrínseco dos tecidos moles. Rastreamento de células baseado em MRI já foi utilizada clinicamente para seguir as células dendríticas em pacientes com melanoma, 2. IRM clínica convencional é realizada sobre o núcleo 1 H, presentes na água celular em tecidos. Também é possível realizar a RM em outros núcleos activos, tais como 13 C, 19 F e 23 de Na. No entanto, apenas 19 F RM tem sido aplicado com sucesso no rastreamento de células in vivo, uma vez que oferece a mais alta sensibilidade após 1 H. A ausência de MRI-detectável endógena 19 M nos tecidos permite alta seletividade sinal para odetecção de agentes de contraste exógenos, 19 F e permite a quantificação da concentração de flúor directamente a partir dos dados de imagem. Para uma discussão detalhada em 19 de F MRI, consulte 3-5. Uma questão fundamental com 19 M MRI é a necessidade de desenvolver e otimizar os rótulos de células 19 f adequado, apesar de vários rótulos foram desenvolvidos, com uma tendência para os agentes multimodais 6.
O protocolo aqui descrito é baseado em estudos realizados por nossos grupos de 7-9, incluindo os primeiros artigos que descreviam in vivo quantitativa 19 célula baseada em ressonância magnética F rastreamento 10,11. O procedimento geral de rastreamento de células utilizando 19F MRI está sumariado na Figura 1. Nós descrevemos um protocolo geral para a rotulagem e de imagem de células dendríticas (DCs), utilizando um agente de contraste perfluorocarbono custom-made 8. O protocolo de imagem é geralmente aplicável a diferentes tipos de células, as etiquetas e os modelos animais. Otipo de célula animal e modelo descrito aqui só deve ser tomada como um exemplo, e, portanto, nós não fornecemos detalhes sobre o isolamento de células e rotulagem, mas sim concentrar-se no protocolo de imagem. Modificações serão necessárias para cada rótulo, tipo de célula, o modelo animal, e configuração de imagem, e estes podem ser encontrados na literatura ou podem precisar de ser otimizada pelos pesquisadores. Algumas modificações comuns estão incluídas na discussão.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui descreve o procedimento geral para a in vivo 19 de rastreamento de células F ressonância magnética. Apesar do método de co-incubação descritas, existem vários protocolos diferentes para a marcação das células com um agente de F 19. No entanto, a co-incubação é mais frequentemente utilizado e pode ser optimizado adicional, por exemplo, por adição de agentes de transfecção 6. O protocolo de marcação celular real dependerá do t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer Nadine Henn e Arend Heerschap por sua valiosa ajuda. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Holandês de Medicina Regenerativa (NIRM, FES0908), o ENCITE programa FP7 da União Europeia (HEALTH-F5-2008-201842) e TargetBraIn (HEALTH-F2-2012-279017), uma bolsa da Fundação Volkswagen ( I/83 443), a Organização Holandesa para Pesquisa Científica (VENI 700.10.409 e Vidi 917.76.363), ERC (Advanced Grant 269019) e Radboud University Nijmegen Medical Centre (AGIKO-2008-2-4).
Materials
| REAGENTS | |||
| PBS | Sigma-Aldrich | MFCD00131855 | |
| TFA | Sigma-Aldrich | 76-05-1 | |
| Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 | |
| Ophtosan | Produlab Pharma | 2702 | eye ointment |
| Material name | |||
| MRI scanner | Bruker Biospec | ||
| NMR spectrometer | Bruker Biospec |
Referências
- Srinivas, M., et al. Imaging of cellular therapies. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1080-1093 (2010).
- de Vries, I. J., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23, 1407-1413 (2005).
- Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28, 363-370 (2010).
- Ruiz-Cabello, J., Barnett, B. P., Bottomley, P. A., Bulte, J. W. Fluorine (19F) MRS and MRI in biomedicine. NMR Biomed. 24, 114-129 (2011).
- Stoll, G., Basse-Lusebrink, T., Weise, G., Jakob, P. Visualization of inflammation using 19F-magnetic resonance imaging and perfluorocarbons. Wires Nanomed. Nanobiol. 4, 438-447 (2012).
- Srinivas, M., Boehm-Sturm, P., Figdor, C. G., de Vries, I. J., Hoehn, M. Labeling cells for in vivo tracking using (19)F. MRI. Biomaterials. 33, 8830-8840 (2012).
- Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23, 983-987 (2005).
- Srinivas, M., et al. Customizable, multi-functional fluorocarbon nanoparticles for quantitative in vivo imaging using 19F MRI and optical imaging. Biomaterials. 31, 7070-7077 (2010).
- Boehm-Sturm, P., Mengler, L., Wecker, S., Hoehn, M., Kallur, T. In vivo tracking of human neural stem cells with 19F magnetic resonance imaging. PLoS One. 6, e29040 (2011).
- Srinivas, M., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using (19)F. MRI. Magn. Reson. Med. , (2009).
- Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58, 725-734 (2007).
- Mangala Srinivas, E. T. A. Cellular labeling and quantification for nuclear magnetic resonance techniques. US patent. , (2007).
- Boehm-Sturm, P., Pracht, E. D., Aswendt, M., Henn, N., Hoehn, M. . Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine. , (2012).
- Insko, E. K., Bolinger, L. Mapping of the Radiofrequency Field. J. Magn. Res. A. 103, 82-85 (1993).
- Haacke, E. M., Brown, R. W., Thompson, M. R. . Magnetic resonance imaging: physical principles and sequence design. , (1999).
- Scheffler, K. A pictorial description of steady-states in rapid magnetic resonance imaging. Concepts Magn. Res. 11, 291-304 (1999).
- Firbank, M. J., Coulthard, A., Harrison, R. M., Williams, E. D. A comparison of two methods for measuring the signal to noise ratio on MR images. Phys. Med. Biol. 44, 261-264 (1999).
- de Chickera, S. N., et al. Labelling dendritic cells with SPIO has implications for their subsequent in vivo migration as assessed with cellular MRI. Contrast Media Mol. Imaging. 6, 314-327 (2011).
