In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

Summary

Se describe un protocolo general para el seguimiento de las células in vivo mediante resonancia magnética en un modelo de ratón con ex vivo las células marcadas. Un protocolo típico para el etiquetado de células, el procesamiento de adquisición de imágenes y la cuantificación se incluye.

Abstract

In vivo ¹⁹ F MRI permite el seguimiento cuantitativo de células sin el uso de la radiación ionizante. Es una técnica no invasiva que se puede aplicar a los seres humanos. Aquí se describe un protocolo general para el etiquetado de células, formación de imágenes y procesamiento de imágenes. La técnica es aplicable a diversos tipos de células y modelos animales, aunque en este caso nos centramos en un modelo típico de ratón para el seguimiento de las células inmunes murinos. Los temas más importantes para el etiquetado de las células se describen, ya que son relevantes para todos los modelos. Del mismo modo, los parámetros clave de formación de imágenes se enumeran, aunque los detalles pueden variar dependiendo del sistema de resonancia magnética y la configuración individual. Por último, se incluye un protocolo de tratamiento de la imagen para la cuantificación. Variaciones para esta y otras partes del protocolo, se evalúan en la sección de Discusión. Basándose en el procedimiento detallado se describe aquí, el usuario tendrá que adaptar el protocolo para cada tipo específico de células, etiqueta celular, modelo animal, y la configuración de imágenes. Tenga en cuenta que la pROTOCOLO también se puede adaptar para el uso humano, siempre y cuando se cumplan las restricciones clínicos.

Introduction

En el seguimiento de células in vivo es esencial para la optimización y la supervisión de la terapia celular ^1. Debido a su naturaleza no invasiva, tratamiento de imágenes ofrece excelentes oportunidades de observar las células in vivo. Imagen de Resonancia Magnética (IRM) es independiente de la radiación ionizante y permite una resolución de imagen superior y el contraste intrínseco de tejido blando. Seguimiento de células basada en RM ya se ha utilizado clínicamente para seguir las células dendríticas en pacientes con melanoma ^2. MRI clínica convencional se lleva a cabo en el núcleo ¹ H, presentes en el agua móvil en los tejidos. También es posible llevar a cabo resonancia magnética en otros núcleos activos, tales como ¹³ C, ¹⁹ F y ²³ Na. Sin embargo, sólo ^{el 19} F MRI se ha aplicado con éxito para el seguimiento in vivo de células, ya que ofrece la más alta sensibilidad después del ¹ de H. La ausencia de la RM-detectable endógena ¹⁹ F en los tejidos permite una alta selectividad de la señal para lala detección de agentes de contraste exógenos ¹⁹ F y permite la cuantificación de la concentración de flúor directamente de los datos de imagen. Para una discusión detallada sobre ^19F MRI, consulte ^3-5. Una cuestión clave con ¹⁹ F RM es la necesidad de desarrollar y optimizar los marcadores adecuados de células ¹⁹ F, aunque se han desarrollado varias etiquetas, con una tendencia hacia los agentes multimodales ^6.

El protocolo se describe aquí se basa en los estudios realizados por nuestros grupos de ^7-9, incluyendo los primeros artículos que describían in vivo cuantitativa ¹⁹ celular basada en RM F seguimiento ^10,11. El procedimiento general de seguimiento celular utilizando ¹⁹ F RMN se resume en la Figura 1. Se describe un protocolo general para el etiquetado y la formación de imágenes de células dendríticas (DCs) utilizando un agente de contraste de perfluorocarbono a medida ^8. El protocolo de formación de imágenes es generalmente aplicable a diferentes tipos de células, las etiquetas y los modelos animales. Lamodelo de tipo celular y animal descrito aquí debe tomarse sólo como un ejemplo, y por lo tanto no proporcionan información sobre el aislamiento de células y el etiquetado, sino que más bien se centran en el protocolo de obtención de imágenes. Las modificaciones serán necesarias para cada etiqueta, tipo de célula, modelo animal, y la configuración de la imagen, y estos se pueden encontrar en la literatura o pueden necesitar ser optimizado por los investigadores. Algunas modificaciones comunes se incluyen en la discusión.

Protocol

Nota: Todos los experimentos y procedimientos con animales deben llevarse a cabo de conformidad con las normas éticas pertinentes y se ajustan con el cuidado animal estándar y los requisitos humanos. 1. Etiquetado celular (Protocolo Estándar con coincubación) Añadir 19 F etiqueta 8 a países en desarrollo inmaduro a una concentración de 4 mg/10 6 células (en el medio 2 ml). Agitar suavemente para mezclar. Se incuban las células co…

Representative Results

Aquí se muestran los resultados típicos de un protocolo que implica la transferencia de 19 células marcadas con F mensajeras a un ganglio linfático de drenaje. Figura 2 muestra un espectro de RMN de 19 F 10 6 células marcadas utilizando una referencia TFA. La configuración de formación de imágenes se llevó a cabo como se describe en el protocolo (Figura 3). Para la formación de imágenes in vivo, se utilizó una referencia consistente …

Discussion

El protocolo descrito aquí describe el procedimiento general para el seguimiento in vivo de células ¹⁹ F resonancia magnética. A pesar de el método de co-incubación descrito, hay varios protocolos diferentes para etiquetar las células con un agente de ¹⁹ F. Sin embargo, la co-incubación se usa con más frecuencia y puede optimizarse por ejemplo, mediante la adición de agentes de transfección ^6. El protocolo de etiquetado real de células dependerá del tipo de …

Materials

			REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
			Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec