Mus embryonale udvikling i et serum-frit Hele Embryo Culture System
Summary
Serum i embryokulturer indeholder ukendte komponenter, der kan påvirke resultatet af eksperimenter især i undersøgelser med signalering interaktioner. Her udnyttede vi en serum-frit iltet kultur system, og vise, at midten af drægtigheden museembryoer dyrket for 16-40 hr udviser morfologiske udvikling sammenlignes med embryoner udvikler sig i livmoderen.
Abstract
Midten af drægtigheden fase musefostre blev dyrket udnytte et serumfrit dyrkningsmedium fremstillet ud fra kommercielt tilgængelige stamcelle medier kosttilskud i en oxygeneret rullende flaske dyrkningssystem. Museembryoer på E10.5 blev omhyggeligt isoleret fra livmoderen med intakt blommesæk og i en proces, der involverer præcis kirurgisk manøvre embryonerne blev forsigtigt eksterioriseret fra blommesækken og samtidig opretholde det vaskulære kontinuitet i foster med blommesækken. Sammenlignet med embryoner tilberedt med intakt blommesæk eller med blommesækken fjernet disse embryoner udstillet overlegen overlevelsesrate og udviklingsmæssige progression når de dyrkes under lignende forhold. Vi viser, at disse musefostre, når de dyrkes i et defineret medium i en atmosfære af 95% O2 / 5% CO2 i en rullende flaske apparat kultur ved 37 ° C i 16-40 timer, udviser morfologiske vækst og udvikling kan sammenlignes med embryoner udvikler sig i livmoderen. Vi tror ther metode vil være nyttig for efterforskerne har brug for at udnytte hele embryo kultur for at studere signalsystemer interaktioner vigtige i embryonale organogenesis.
Introduction
In vitro-dyrkningsmetoder udnytter hele embryoner er velegnede til at studere signalering mekanismer involveret i embryonale organogenesis, som ellers er svært tilgængelige i livmoderen. Hele embryoner giver vævet integritet og støtte passende for væv interaktioner, der er afgørende for rettidig forekomst af signalering mekanismer væsentlige for forskellige cellulære processer under organogenesen. Mens hele embryokulturer skabe en platform for et væld af applikationer såsom transplantationscentre undersøgelser, genetiske og væv manipulationer, perle implantationsforsøg, toksikologiske undersøgelser osv., Som i øjeblikket anvendes embryo kultur systemer er primært afhængig af serum for korrekt vækst og vedligeholdelse af embryonerne i kulturen 1-9.
Serum er blevet udnyttet som en af de vigtigste komponenter, der spænder fra 10-100% af dyrkningsmediet 6-8, 10, 11.; Imidlertid sammensætningen af serum er ikke veldefineret og kan variere fra dyr til dyr, og hver gang serummet opsamles. Mens udarbejdelse af serum laboratorium er tidskrævende og indebærer strenge procedurer, serum indkøbt kommercielt udviser betydelig variation mellem forskellige partier og rejser eksperimentelle omkostninger. Tilføjet til disse, kan serummet indeholde ukendte faktorer såsom vækstfaktorer, hormoner eller andre proteiner, som potentielt kan påvirke resultatet af visse eksperimenter, især dem, der involverer undersøgelse af signalmolekyler er vigtige i vævsinteraktioner. Undersøgelser har vist, at tilsætning af serum til kulturen kan potentielt ændre de intracellulære niveauer af visse signalmolekyler, såsom cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) og proteiner involveret i mitogenisk signalering og phosphoinositid 3 (PI 3)-kinase signalveje 12-14. I modsætning til disse, et serumfrit dyrkningssystem tilvejebringer fordelene antigen frit miljø,afholdenhed fra biologisk aktive enzymer, som kan ændre de cellulære processer og giver sammenhæng mellem eksperimenter.
I den foreliggende undersøgelse har vi anvendt et serumfrit dyrkningsmedium fremstillet ud fra kommercielt tilgængelige stamcelle medier kosttilskud til kultur midten af drægtigheden stage hele embryoner i en atmosfære af 95% O2 / 5% CO2 i en rullende flaske apparat kultur ved 37 ° C 15,16. Museembryoer dyrket for 16-40 timer under disse definerede betingelser udstillet progression i morfologiske udvikling af overordnede embryonale krop og forskellige strukturer såsom hjerte, lemmer, hjerne og øjne med angivelse af passende niveauer af cellulær proliferation, migration, differentiering og væv interaktioner. Molekylær analyse af den embryonale udvikling i kulturen for en af de komplekse organsystemer såsom øjet afslørede okulær udvikling at være i overensstemmelse med den observeret i øjenvæv i embryos udvikler sig i livmoderen (Kalaskar og Lauderdale, under udarbejdelse). Således viser vi, at museembryoer dyrkes ved midten af drægtigheden scene, udviser progressiv vækst og morfologiske udvikling sammenlignes med observeret i fostre udvikler sig i livmoderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Midten af drægtigheden fase musefostre blev dyrket i et serumfrit dyrkningsmedium i en atmosfære af 95% O2 / 5% CO2 i en rullende flaske apparat kultur ved 37 ° C. Embryo udvikling ex utero var kritisk afhængig af flere faktorer på hvert trin under proceduren fra det tidspunkt, hvor livmoderen er isoleret fra aflivet mus til færdiggørelsen af kultur (figur 1). Den vigtigste faktor, der påvirkede udviklingen var den tid, det tager at starte kulturen. De andre kritis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Julie Gordon og Dr. Nancy Manley for deres nyttige råd med kulturen teknik. Dette arbejde er blevet støttet af Børnenes Glaukom Foundation og Sharon-Stewart aniridi Research Trust.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
Referências
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
